中国约有60多种毒蛇，毒蛇咬伤是我国频发事件[10,11]。本次研究对象是孟加拉眼镜蛇(Naja kaouthia)，一种临床上重要的眼镜蛇，广泛分布于东北印度、孟加拉、马来西亚、印度支那半岛、尼泊尔以及中国西南地区(云南、四川和广西三省)[12]。孟加拉眼镜蛇咬伤会引发一系列非常严重的症状，包括下垂症，吞咽困难，唾液分泌增多，甚至导致昏迷和呼吸麻痹死亡[13–15]。最近有关于孟加拉眼镜蛇蛇毒蛋白组学和潜在作用的研究从其粗毒中确定了12个蛋白质家族，其所含成分以3-FTx和PLA2为主，分别占毒液总量的77。5%和13。5%[16]。类似的蛋白质组也已在马来西亚，泰国和越南地区孟加拉眼镜蛇的毒液中确定。不过随着地理位置的变化，毒液的组成和丰度表现出显著差异，而这现象很可能与蛇毒致死性差异相关[17]。然而，由于孟加拉眼镜蛇毒腺转录轮廓尚未被研究，我们仍然不能对蛇毒的蛋白质表达谱有更深的了解。众所周知，抗蛇毒血清对毒蛇咬伤治疗是最有效的，泛区域多价，区域单价或单克隆抗蛇毒血清应该被推荐设计和制备 [18–22]。然而，抗蛇毒血清的高投资发展和相对较低的医疗市场需求之间的矛盾导致了商业抗蛇毒血清种类的单一，而且有时候蛇伤患者不得不注射同种或发育系统相关的蛇的抗蛇毒血清，而不是特异性的针对咬伤蛇的抗蛇毒血清，例如，在中国被孟加拉眼镜蛇咬伤是通过注射中华舟山眼镜蛇单价抗蛇毒血清治疗的。实际上，在中国被孟加拉眼镜蛇咬伤和被舟山眼镜蛇咬伤是没有严格区分的，因为这两种眼镜蛇有一个重叠的分布范围、形态相似，甚至引起相似的临床症状。据我们所知，没有特别针对中国孟加拉眼镜蛇咬伤而研发的抗蛇毒血清在市场上流通，而且商业舟山眼镜蛇抗蛇毒血清在治疗孟加拉眼镜蛇咬伤的临床应用评估上缺乏充分证据。在这里，我们采用蛋白质组学技术分析中国孟加拉眼镜蛇蛇毒蛋白组。为了了解毒液在毒蛇咬伤中的潜在作用和评估市售舟山眼镜蛇抗蛇毒血清对中国孟加拉眼镜蛇咬伤的治疗功效，我们还评估了蛇毒粗毒毒理和酶活性，并基于孟加拉眼镜蛇的毒液和舟山眼镜蛇抗蛇毒血清进行了第二代抗蛇毒性检测。

二、 材料与方法

(一) 蛇毒和抗蛇毒血清

我们于2016年在广西省百色市收集了两只成年孟加拉眼镜蛇(图1)，并把它们带到我们杭州的实验室采毒。通过毒蛇咬封口膜包裹的烧杯提取蛇毒。新鲜毒液在4°C下10000g离心去除杂质15分钟、冻干，混合均匀并存储在−80°C直到使用。单价舟山眼镜蛇抗蛇毒血清(1000IU/韦尔)，该血清从马血浆制备，含有纯化的F(ab’)2片段。血清冻存于−80°C，使用时重新溶解。根据Bradford[23]测定蛇毒组分的蛋白质浓度。分光光度法用1厘米光光程的比色皿基于280nm下(ε)1。4为1mg/ml蛋白的消光系数测定抗蛇毒血清浓度。文献综述

(二) 蛇毒蛋白的分离与鉴定

取蛇毒5毫克溶于0。1%三氟乙酸(TFA，溶液A)，在4°C 下10000g离心10分钟，将其填充在Kromasil C18 反相柱(250×4。6mm，直径 5μm)上，使用 Waters E600 HPLC 系统。设置流速为1ml/min分离蛇毒。流动相分别为0。1%三氟乙酸(溶液A)和乙腈(溶液B)。按照以下步骤：洗脱(10%B)5分钟，其次是10–25%B 15分钟，25–45%B 80分钟，45–60%B 20分钟。蛋白检测在215nm。手动收集组分，用离心干燥机干燥。将蛋白质溶解在加样缓冲液中，用于18%或12%的SDS-PAGE分离。电泳完成后用0。2%考马斯亮蓝R-250(CBB)染色，并用UMAx2100扫描仪扫描拍摄结果。