8。 阳性克隆的筛选及鉴定 14

9。 pGBKT7/ACMV- Rep，pGBKT7/ACMV- Rep*，pGBKT7/ACMV- mRep阳性克隆的大量获得及纯化 15

10。 pGBKT7/ACMV- Rep，pGBKT7/ACMV- Rep*，pGBKT7/ACMV- mRep阳性克隆的酶切验证 15

11。 pGBKT7/ACMV- Rep，pGBKT7/ACMV- Rep*，pGBKT7/ACMV- mRep阳性克隆的测序验证 15

12。 酵母菌株AH109的复苏活化及感受态细胞的制作 15

13。 质粒转化酵母细胞（常规转化）： 15

14。 酵母转化pGBKT7/ACMV- Rep，pGBKT7/ACMV- Rep*，pGBKT7/ACMV- mRep阳性克隆的筛选 16

1) 酵母中质粒的抽提： 16

2) 酵母中抽提的质粒进行阳性克隆的鉴定 17

实验结果与分析 18

全文小结 21

参考文献 23

前言

植物病毒是可在植物上进行传播，并引起严重植物病理症状的一类微生物，植物病毒病害的爆发常导致农产品的减产和绝收。分类上属于双生病毒科（Geminiviradae）的粉虱传双生病毒(WTG)是一类具有孪生颗粒形态的植物单链 DNA 病毒，我国检测和分离到的双生病毒分类上均属于菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）。该属病毒的寄主范围基本限于双子叶植物，但传播广泛，其自然传播媒介均为烟粉虱（Bemisiatabaci），故又称为粉虱传双生病毒 (1,2)。

据2013年统计，至少有43个国家的木薯、棉花、番茄等粮食和经济作物都受到粉虱传双生病毒病害的影响，多数情况下造成毁灭性的危害。自1990年起，粉虱传双生病毒在印度、巴基斯坦等周边国家多次大爆发，流行范围广，时间长。在我国云南、广东、广西、四川、海南、台湾、辽宁、北京、内蒙古等地相继发现粉虱传双生病毒的传播和流行，并在烟草、南瓜、番茄等多种紧急作物上爆发并造成严重危害，导致减产过半甚至绝收(3,4,5,6)。对于双生病毒的迅速蔓延和严重危害威胁，要求我们对于双生病毒病的进行更深入的研究，在实际生产中对双生病毒进行有效的控害减灾。

非洲木薯花叶病毒（ACMV）为菜豆金色花叶病毒属的代表成员。ACMV 颗粒中含对植物系统性侵染必需的双组分单链环状 DNA，分别称为 DNA-A 和 DNA-B。DNA-A与病毒的复制和介体传播有关；DNA-B 与病毒运输和病毒的寄主范围有关，并依赖于DNA-A 共同复制(6)。From优Y尔E论W文W网wWw.YouERw.com 加QQ75201,8766

研究发现，Rep 蛋白是双生病毒复制的关键。在复制结束时，Rep 蛋白再次环化新生成的 ssDNA (7,8)。

植物病毒所编码的功能蛋白中，只有很少数的蛋白参与了病毒的复制过程。例如，ACMV病毒DNA 仅编码2 个参与复制的蛋白，一个是复制相关蛋白（Rep），另一个是复制增强蛋白（REn）。双生病毒并不编码复制过程所必须的 DNA 聚合酶和相关的辅助因子，但是可以利用寄主植物体内的复制系统来协助它完成复制过程，双生病毒的复制酶Rep 蛋白可作用于植物内源 RBR蛋白（参与细胞周期调控），通过与之互作，调控植物寄主细胞从复制机能停滞的G0、G1期进入复制分裂S期，来初始化病毒DNA的复制。Rep蛋白还具有识别复制起始位点(TAATATTQ|AC)，结合 DNA，起始病毒环状分子开始滚环复制的功能。Hanley-Bowdoin等（1999）研究发现，双生病毒侵染植物后能诱导寄主提供便于病毒有效复制的环境，从而克服植物细胞在某些发育阶段缺少病毒DNA 复制所必需的聚合酶的这个障碍。