3。1 研究意义 11

3。2 展望 12

参考文献： 12

致谢 13

引言

　核糖体作为蛋白质合成的场所, 于生物体的细胞代谢中具有十分重要的地位。其复杂的结构是人们了解生物大分子及其复合物结构与功能关系一个十分典型的范例。因此, 从确定核糖体的生物学功能以来, 生物学家就对其发挥功能的结构基础非常关注, 希望通过解开核糖体的结构之谜来进一步解答生物更多的奥秘[1]。核糖体大亚基（英文：Ribosomal Large Subunit，简称“S”）是核糖体中较大的一类核糖体亚基。核糖体蛋白L10是一种普遍存在的蛋白质，属于核糖体蛋白L10e家族成员。核糖体中，RPL10位于核糖体的中央突起以及GTP活化中心的深裂中。它能参与到40S和60S核糖体亚基，从而使之成为有生物功能的80S核糖体[2]。From优T尔K论M文L网wWw.YouERw.com 加QQ75201^8766

拟南芥基因组中RPL10有三个同源基因At1g14320,At1g26910和At1g6658,分别命名为RPL10A,RPL10B和RPL10C[3]。目前已经发现RPL10A对植株的株高有一定的调控作用，同时还与植物抵抗菜豆金色花叶病毒有一定的联系。而RPL10A的亚细胞定位对于研究其功能具有非常重要的作用。因此本文将对RPL10A蛋白质的亚细胞定位以及生物信息学的分析预测进行比较，为今后研究植物抗病毒机制提供线索。

    本实验采用激光共聚焦技术观察RPL10A融合荧光蛋白的亚细胞共定位方法。使用绿色荧光蛋白( green fluorescent protein，GFP)。GFP是水母体内的天然蛋白，其作为报告蛋白可以植动物以及微生物等多种生物体中成功表达。由于 GFP 作为报告蛋白不需抗体、辅助因子、酶底物等其他成分，也不影响宿主细胞的活力，因而可以鉴定、跟踪、分选表达 GFP 的细胞[4]。而亚细胞定位瞬时表达的宿主主要是拟南芥原生质体、烟草叶片和洋葱表皮细胞等。本实验采用的载体是洋葱表皮细胞及烟草叶片。洋葱表皮细胞结构清楚，取材便捷，是观察外源基因瞬时表达的好材料。洋葱表皮细胞中瞬时表达外源基因的方法主要有农杆菌介导法、基因枪轰击法2 种。本实验使用的是基因枪法，其实验的基本原理是通过动力系统将吸附在金属颗粒表面的带有目标基因载体DNA，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现瞬时转化的目的。然后我们利用激光共聚焦显微镜对融合GFP的重组荧光蛋白的亚细胞定位的结果进行观察。激光共聚焦显微镜（LSCM）是20世纪80年代发展起来的将激光扫描、计算机自动化分析与显微镜技术相结合的细胞生物学分析仪器。LSCM是光学显微镜的极大改进，其分辨率比较高，约为普通光学显微镜的3倍[5]。

1 材料与方法

1。1  实验材料

GFP表达载体：

pCAMBIA1300/35S:GFP载体来自浙江大学生命科学学院，保存在E。 coli strain DH5α中，保存于-80℃。

分子生物学试剂：

制性内切酶BamH I （#R3136L）

Sal I SalⅠ（货号: #R3138L），T4 DNA 连接酶（货号: #M0202L）均购自New England Biolabs ；

2×Taq Mix(货号: CW0690M)，大肠杆菌DH5α(货号: CW0808A)均购自康为世纪。

线粒体定位染料：论文网

Mito Tracker Red CMXRos

基因枪操作相关材料与试剂：

新鲜洋葱，70%乙醇，无水乙醇，氯化钙，蔗糖溶液，金粉，甘油，亚精胺。