培养基：含46。67g/L 的甘露醇和46。67g/L 的山梨醇的 MS基本培养基。

1。2实验操作

1。2。1 基因克隆

PCR，酶切和连接

1。PCR反应程序：

95℃               5min

95℃               30s

58℃               30s 

72℃               1min（延伸效率1kb/min）

35个循环

72℃               5min

2。PCR产物双酶切体系

10×NEB Buffer3

PCR产物BamH ISal I3ul

25ul（3-5ug）

1ul1ul37℃温育3h

3。35S:GFP载体双酶切体系

10×NEB Buffer3

pCAMBIA1300/35S:GFP载体质粒

BamH I

Sal I

双蒸水 3ul

5ul（3ug）1ul1ul

20ul（共30ul）

37℃温育3h

4。载体连接

连接体系10×T4 DNA 连接酶 Buffer

PCR产物

pCAMBIA1300/35S:GFP载体

T4 DNA 连接酶 1。5ul

11。5ul（约1ug）

1ul（约100ng）1ul

16℃ 30min或4℃过夜

1。2。2大肠杆菌转化

  首先将产物转化到大肠杆菌中， 再进行菌液PCR筛选阳性克隆，然后利用DNA测序验证其阳性，最后进行质粒提取的操作

1。转化文献综述

    连接产物转化到大肠杆菌DH5α

1) 在超净工作台上取10ul的连接产物，加入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。

2) 冰上放30分钟，42n热击1分钟，冰上放5分钟。

3) 往感受态细胞体系中加500ul无抗LB培养基。

4) 将反应体系于37℃摇床200转摇1小时。

5) 将所有的大肠杆菌4000转离心两分钟后，吸去400ul后将剩余的菌液涂布到LB含有卡那霉素抗性的固体培养基上。

6) 37℃培养过夜