基于FISH的蚕豆染色体核型分析(2)
蚕豆具有较大的染色体，在豆类作物中具有最大的基因组和最好的细胞遗传特征，为开展染色体研究奠定了很好的基础。Vandana et al.(2013)对不同蚕豆核型分析发现，一般情况下，蚕豆具有12条染色体，其中，近端部着丝粒染色体是最常见的类型，6对染色体平均长度为11.33 μm，其中最长的染色体长度范围为5.66 μm至20.00 μm [2]。在不同蚕豆品种中，有丝分裂中期染色体长度范围介于49.81μm至62.00μm，且最长的一对染色体带有随体[3]。蚕豆染色体组组成也存在着较大的变异性，其中约有94％的品种是二倍体，6％为多倍体。在二倍体中，53％的品种染色体基数x = 7，染色体基数x = 6的品种占33％，其余8％为x = 5的类型；在多倍体中，目前研究发现全部为四倍体，且基本染色体数为x = 6或x = 7，染色体数为24或28条[4-5]。商效民(1985)认为蚕豆植株表现出的异常生长，甚至不育是与植物体中大量存在具随体断片的变异核型有关[6]。Fuchs et al.(1994)用具有重建核型（ACB）的蚕豆染色体与包含有重复Fok I序列的生物素化探针原位杂交，通过DOP-PCR（简并寡核苷酸引发的聚合酶链反应）扩增来自不含有该序列的染色体的DNA和含有分散的重复序列的探针，结果表明，大多数标记带位于染色体臂中间位置，主要或完全由FokI重复序列组成[7]。Fuchs et al.(1998)发现各种Giemsa、限制性内切核酸酶、荧光染料带型模式、重复序列、编码序列以及组蛋白乙酰化模式等可以用来区分和分析端粒、亚端粒、着丝粒、NOR、5S rRNA基因座的结构以及间期异染色质的两种主要类型[8]。Nouzova et al.(1999)从蚕豆基因组中分离出5个高度重复DNA序列(TIV10,TI33, TIII17, HII2/7和 RS2/11)，序列的长度为109至584 bp。用各种限制酶消化基因组DNA之后，通过琼脂糖凝胶电泳克隆明显的条带，研究其拷贝数和基因组组织的特征以及在其他豆科植物中的分布。实验表明，正是这5个高度特异的DNA序列显示出了与基因组DNA的强杂交信号[9]。Nath et al.(2010)研究表明，BamHI家族重复序列分布在常染色质和异染色质中，在蚕豆总共85％的DNA重复序列占21%，通过杂交水平可以清楚地区分蚕豆和其他物种的基因组，为蚕豆核型的建立奠定基础[10]。Fuchs 和Schubert（1995）通过荧光原位杂交技术，研究了蚕豆种子蛋白基因在中期染色体上的定位[11]。Hizume（1993）利用5S RNA探针对不同物种进行研究分析发现，真核基因组包含有多个5S RNA序列，且在所有细胞核和染色体上均能清楚地观察到信号。5S RNA序列高度保守，但是在蚕豆、豌豆、亚麻、玉蜀黍、大麦不同的物种中间隔的长度和基本的序列不一样。 [12]。Raina et al.(2001)对蚕豆中18S-26S和5S核糖体RNA基因家族进行物理作图表明，一般意义上来说，两个核糖体DNA探针数量，大小和位置的可变性可以用于区分物种。但对于复杂的物种间，核型无法单独确定两个核糖体基因家族在染色体上的分布基础[13-14]。
但目前国内外大多仅针对蚕豆各染色体长度、臂比及核型类别进行研究，有关建立蚕豆染色体高清核型的研究及其探讨重复序列分布的研究仍然比较落后，有待于进一步探索。由于良好的遗传基础、丰富的遗传背景、多色荧光原位技术的发展，蚕豆具有较大的研究潜力。
多色荧光原位杂交以质粒克隆作为探针，为染色体识别提供了强有力的工具。但由于重复序列的探针数目有限，额外的成本和劳动力的花费影响这些探针的使用[15-16]。寡聚核苷酸（Oligonucleotides）是一类长度约几十碱基的短核苷酸的总称，容易与DNA分子、蛋白质或药物小分子相互作用。寡核苷酸探针包含更多的核苷酸和重复单元，用于携带有目标基因的特定染色体的荧光原位杂交，在基因组重复序列的基础上进行设计而不受限制，能够产生更强的信号[17-18]。此外，相比于较长的质粒探针，短的寡聚核苷酸探针不仅可以产生质粒探针相同的杂交信号，也可以产生更多的甚至与质粒探针完全不同的杂交信号，再结合一些新的寡聚核苷酸探针，可以有效地提高染色体和染色体区段识别率。寡聚探针容易设计、合成、改变，任意已知DNA序列均可开发寡聚核苷酸探针，增加核型的分辨率，提高效率和精确性、灵敏度高[19] ，可以直接人工合成和标记修饰，省去了质粒保存、繁殖和标记的程序，更简单、经济有效。其次，利用基因组特异序列开发的寡聚核苷酸探针可以鉴别不同物种[16]。