大肠杆菌可诱导性前噬菌体宿主谱改造试验(2)
本实验针对大肠杆菌噬菌体尾丝蛋白的改造方法中使用到了大肠杆菌的无痕缺失技术[7]，该技术是利用Red同源重组技术将目的基因片段替换为氯霉素抗性基因和I-SceI酶切位点，再将改造完成的质粒pWRG99在L-阿拉伯糖诱导下使融合的同源片段与抗性基因两侧的同源序列发生同源重组，然后使用四环素诱导质粒pWRG99表达I-SceI核酸内切酶，使未发生重组的细菌DNA双链结构断裂，在抗性平板上筛除未重组的菌株[8]。本实验采取直接在细菌基因组上进行的无痕缺失操作的方法，对前噬菌体基因进行了操作，降低了操作难度。[9，10]
1材料与方法
1.1菌株和质粒
本实验使用的大肠杆菌菌株48-3、MC1061、DH5α、BL21均由本实验室于不同时间和地点从患有败血症和神经症状的病鸭的体内分离[11]。另外，猪源大肠杆菌菌株K88由本实验室保存。本实验使用的质粒pWRG99由本实验室前期工作中自己构建，pKD46由本实验室保存。所有菌株使用LB培养基在37 ℃恒温条件下培养。后期的筛选过程中，在LB培养基中加入下列浓度的抗生素：氨苄青霉素（100μg/mL），卡那霉素（50μg/mL），氯霉素（30μg/mL），盐酸四环素（5μg/mL）。
1.2培养基和主要试剂
LB液体培养基：10 g/L NaCl，10 g/L蛋白胨（TRYRTONE），5g/L酵母粉（Yeast Extract）。
LB半固体培养基为LB液体培养基中加入0.5%琼脂粉。
LB固体培养基为LB液体培养基中加入1.5%琼脂粉。
SM缓冲液：2 g/L MgSO4.7H2O，0.1 g/L明胶，5.8 g/L NaCl，50 mM/L Tris-HCl，调节pH值在7.5。
PBS 缓冲液（pH7.5）：80 g/L NaCl，2 g/L KCl，35.8 g/L Na2HPO4，2.7 g/L KH2PO4
DnaseI购自Thermo公司，RnaseA和丝裂霉素C（Mitomycin C）购于鼎国昌盛生物技术有限公司，2×Vazyme Lamp Master购自诺唯赞公司，噬菌体基因组提取试剂盒购自北京艾比根生物技术有限公司，细菌基因组提取试剂盒OMEGA细菌DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.® Bacterial DNA Kit），PEG8000购自生兴生物技术有限公司。
1.3主要仪器
PCR仪（Mastercycler personal）、电转化仪（BIORAD GENEPULSER Ⅱ）、凝胶成像系统（Gene Genius BIO IMAGING SYSTEM）、核酸紫外线检测仪（Eppendorf Biophotometer）
1.4研究方法
1.4.1噬菌体的分离、纯化及增殖
噬菌体P88的分离通过丝裂霉素C裂解溶源菌获得。首先在LB液体培养基中接种大肠杆菌K88，37℃条件下培养5 h，然后按照1:100接种于新鲜的LB液体培养基中。当浓度达到OD600为0.2时，加入丝裂霉素C，至终浓度500 ng/mL。将加入了丝裂霉素C的菌液置于37 ℃摇床培养10 h，然后将菌液在4 ℃条件下离心3,500 × g，10 min，收集上清，用0.22μm的滤器进行过滤，置于4 ℃冰箱内保存。
噬菌体的增殖方法有双层平板法[12]和液体增殖法。
（1）双层平板法：对噬菌体样本进行倍比稀释，设置多个浓度梯度，将不同浓度的噬菌体与宿主菌通过双层平板法进行培养，选取噬菌斑界限彼此相连的平板对应的浓度，进行大量增殖。然后向每个平板中加入4 mL SM缓冲液，封口膜封口后置于4 ℃，60 rmp的摇床振摇约2 h，避免转速过大，破坏噬菌体尾部结构，将液体吸出，以6,000×g，离心5 min，收集离心后的上清，用0.22μm的滤器进行过滤，置于4 ℃冰箱内保存。
（2）液体法：将新鲜培养的菌液接菌，当细菌浓度达到OD600值约为0.2时，加入噬菌体原液（不同的噬菌体具有不同的生长情况，实验时选取不同浓度梯度进行预实验，计算噬菌体的最适生长比，确定加入噬菌体的量）。放入37 ℃摇床培养，直到菌液澄清。将培养物6,000×g，离心5 min，收集上清。