2. 材料与方法
2.1菌株
用于LamC表达的工程菌株Origami 2(DE3)-pET 32a-lamC。
2.2培养基与溶液
1. LB(Luria-Bertani)培养基
5 g/L 酵母浸出物,10 g/L 胰蛋白胨,10 g/L 氯化钠, p H 7.0。121℃,高压蒸汽灭菌 20 min。固体LB培养基则添加15 g/L琼脂。
2.    卡那霉素(Km)
称取卡那霉素5 g,溶于100 ml 水,配成50 mg/mL的母液,过滤除菌,4°C贮存,使用浓度为50 μg/mL。
3.    诱导剂:异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)
称取IPTG 23.8 g,溶于100 ml 水,灭菌水配成1M的母液,过滤除菌,-20°C贮存,使用浓度为1 mM.
4.    1.5 M Tris-HCl(pH8.8)
称取181.7 g Tris,加约900 mL去离子水揽拌至完全溶解,然后用浓HCl调pH值至8.8,将溶液定容到1000mL后,室温保存。
5.    1M Tris-HCl(pH6.8)
称取121.1 g Tris,加入约900 mL去离子水揽拌至完全溶解,然后用浓HCl调pH值至6.8,将溶液定容到1000 mL后,室温保存。
6.    30%Acrylamide
称取丙烯酰胺290g,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺10g,溶解于800ml去离子水,将溶液定容到1000 mL,用0.45μm滤器过滤后于棕色瓶中保存。
7.    10%(W/V)SDS
称取10g SDS,加入约90 mL去离子水70°C加热溶解,然后用HCl调pH值至7.2,将溶液定容到100 mL,室温保存。
8.    5×SDS-PAGE 电极缓冲液
称取Tris粉末15.1g、Glycine(甘氨酸)94g、0.5%(W/V)SDS5.0g,溶解于 800ml 去离子水,搅拌至完全溶解,将溶液定容到1000 mL后,室温保存。
9.    10%(W/V)过硫酸铵
称取1 g过硫酸铵,加入10 mL的去离子水后搅拌溶解。
10.    考马斯亮蓝R-250染色液
称取1g考马斯亮蓝-250,加入250 mL异丙醇和100 mL冰醋酸搅拌至完全溶解,定容至1000 mL后,用滤纸去除颗粒物质,室温保存。
11.考马斯亮蓝染色脱色液
加入100 mL冰醋酸和50 mL乙醇搅拌至完全溶解,定容到1000 mL,充分混合后使用。
12.2 M咪唑
称取咪唑13.62 g,加入90 mL去离子水完全溶解,浓HCl调pH 7.4,定容至100 mL,0.45μm滤膜过滤除去杂质。用20M Tris-HCl(pH7.0)分别稀释成20mM、50mM、100mM、200mM、300mM咪唑,备用。
13. PBS缓冲液
Content                   concentration(g/L)
NaC                               l8
KCl                               0.2
Na2HPO4                           2.9
K2HPO4                           0.27
加入约900 mL去离子水搅拌至完全溶解,将溶液定容到1000mL后,调pH至7.3,室温保存。
2.3 结晶试剂及器材
   Crystal Screen 1,Crystal Screen 2,Crystal Screen lite, Crystal Screen Cryo, Index和Additive Screen试剂盒及常规蛋白质晶体操作所需工具购自Hampton research。
48槽双孔坐滴结晶板均购自博亚捷晶科技(北京)有限公司。15L保存以及运输晶体所需液氮罐购自四川亚西橡塑机器有限公司。晶体生长用恒湿箱购自华利达实验仪器厂,解剖镜Nikon SMZ-10,冷光源南京天龙光学仪器厂LGY250H型LED光源。
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