梨石细胞形成和Metacaspase基因的关系(2)
表4 梨Metacaspase同系基因的特征分析9
梨石细胞形成和Metacaspase基因的关系 ‘砀山酥梨’（Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’）是一种驰誉中外的梨品种，因为出产于安徽省砀山县而得名，该品种梨个大核小，皮薄汁浓，果皮黄亮，果肉呈乳白色，口感较粗，有淡淡的清香。‘砀山酥梨’不仅含有丰富的营养成分，还有独特的食疗功效。近年来，由于品种逐渐退化以及栽培管理技术不到位等原因，梨石细胞含量增多，导致果肉质地变粗，口感多渣，对果实品质造成了严重的影响。因此，关于梨果实石细胞形成机理的研究，对于改善我国梨品质具有十分重要的意义。
梨果实石细胞是一类强烈木质化的细胞[1]，其含量、大小和密度都是影响果实品质的重要指标，石细胞的形成发育会受到生理因素、基因、环境等因素的调控。果实发育过程中木质素发生沉淀，从而形成石细胞。近年来，国外各方面的研究表明木质部和导管分子的形成[2-3]等都可诱导植物细胞发生细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD），植物PCD同植物细胞的木质化等密切相关。活性氧( reactive oxygen species，ROS )是诱导PCD的一个重要信号分子，氧化胁迫诱导的植物细胞 PCD与相关代谢过程的蛋白相关。Metacaspase是植物PCD发生过程中普遍存在的一类蛋白酶，利用Caspase抑制剂的生化方法和转基因研究亦证明Metacaspase蛋白酶参与了植物PCD的调控[4]，其很有可能是PCD核心机制的一部分。本研究以‘砀山酥梨’为材料，对果实发育过程中不同时期的石细胞、木质素和过氧化氢含量进行测定，分析梨果实石细胞形成过程中生理因素可能存在的作用，并克隆与梨石细胞形成有关的Metacaspase基因，讨论石细胞PCD与木质化关系以及植物Metacaspase在PCD中的可能作用，旨在为探索调控石细胞形成发育的关键基因提供一定的理论依据，针对梨品质下降的现实问题，提出选育培养良种梨的相关建议。
1 材料与方法
1.1 试材及取样
试验材料为‘砀山酥梨’（Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’），选择树势健壮，栽培管理相同的果树，依据陶书田等［5］的方法对梨果实发育过程中石细胞团发育规律进行研究，从梨盛花期正常授粉后15d至果实膨大期，根据果实发育状况每隔7d采一次样（果实发育前期为5～6d）。每次采集果实20个（幼果适当多采），当天用冰袋保存由试验田带回实验室，样品清洗去皮将果肉削成片，经液氮速冻后装袋于-20℃冰箱中保存备用，留一部分直接进行RNA的提取。
1.2 不同时期梨果肉中石细胞含量的测定
石细胞的分离采用冷冻分离［6］和盐酸处理［7］相结合的方法。取大小基本一致的果实3～4个，削皮，仅采用果肉部分，按四分法取样，称取100g样品，并置于-20℃低温冰箱冷冻。24h后取出样品放置室温解冻，加入200mL蒸馏水，并用组织捣碎机(1000～1500 r•min－1)持捣碎3min，将匀浆完全转移到1000mL的烧杯中，加入700mL蒸馏水，用玻璃棒均匀搅拌1min，之后再静置3min，使石细胞充分沉降，然后倾出上层悬浮液，取下层沉淀物悬浮于0.5mol•L－1盐酸中30min，弃去漂浮物，沉淀用蒸馏水洗涤。共需漂洗5～6次，将前两次漂洗倾出的上层悬浮液收集，进行二次漂洗。合并所有收集到的石细胞，用粗滤纸过滤，最后分离得到纯净的石细胞，置于烘箱中烘干至恒质量，称重。
1.3 不同时期梨果肉中木质素含量的测定
梨木质素含量测定参考 Klason方法。取处理好的梨果肉薄片烘干，研磨成均匀粉末，过筛（200目）；甲醇抽提后烘干，取0.2g干粉，用15mL72﹪H2SO4在30℃下抽提1h，加入115mL蒸馏水持续煮沸1h，加热时要注意保持总体积不变；将充分反应的混合液过滤，量取500mL热水反复冲洗滤渣，至冲洗液呈中性，收集洗干净的滤渣，所得到的木质素烘干后称重。