1。1 Isl1基因简介

转录因子1（Islet1，ISL1），也被称作胰岛素增强子结合蛋白1（insulin gene enhancer binding protein1），在20世纪九十年代于大鼠的胰岛素瘤细胞系RIN的cDNA文库中发现，同时进行克隆以及测序。Isl1基因具有高度的种属保守性，在啮齿类动物以及人中，其编码产生的氨基酸序列具有一致性。

Isl1是多效转录因子之一，对同一个体的不同组织及其不同时期都具有不同的调控作用。处于胚胎状态时，Isl1能够影响细胞的分化和迁移，进而对心肌的发育运动神经元的分化、运动神经元的分化以及胰腺的形成起到非常关键的作用。当幼体出生以后，Isl1将以维持细胞表型的作用在胰岛组织、神经系统中继续发挥，其不正常的表达都能引起糖尿病或神经系统疾病。

在运动神经元及胰腺中Isl1的作用是能够促进细胞增殖：Isl1基因在人的4种胰岛细胞是在胚胎8周（小鼠：E8。5天）时开始表达并逐步增加，表达水平在出生后整个生命期均维持中等丰度水平。

1。2因敲除原理

基因敲除技术我们又称之为基因打靶,它是指在分子水平上通过将一个基因除去或者进行替换，然后以整体的表现形态来观察其实验动物性状，通过这种实验手段来对应基因的功能进行推测。

在基因敲除中，以往的载体重组技术主要是载体替换性系统以及载体插入性系统两种。首先来看载体替换性系统，载体替换性系统则主要包括这些，同源序列片段、替换基因的启动子、报道基因等所组成。再来看载体插入性系统，载体插入性系统在载体构建时主要包括所要插入的基因片段(我们俗称的目的基因)、同源序列片段、标记基因片段等所组成。对于传统方法和正负双向的筛选策略中基因敲除需要满足以下条件：对基因组的提取处理可以用来载体构建所处于打靶区的两翼所共同具有的长度足够并且具有特异性的同源片段,方便其以Southern印迹来证实；从而使Isl1/Isl2基因的整合；同源重组区域胸苷激酶基因在任意重组中的活性；然后将打靶结构外特异的基因作为探针与酶切的合适位点进行整合, 以便Southern印迹对过程中出现的特异大小条带分析验证。

本实验应用Cre-LoxP重组酶系统构建转基因小鼠，在小鼠局部实现基因敲除，很多程度上避免了小鼠过早死亡，为后续研究提供可行性。结合转基因技术运用显微注射仪或电穿孔转入预研究基因。

1。3实验流程来自优Y尔L论W文Q网wWw.YouERw.com 加QQ7520~18766

已知Isl1基因小鼠胰腺内特异性表达，本课题欲通过Isl1基因敲除小鼠模型构建，主要包括采样、DNA提取、DNA浓度测定、PCR温度梯度、PCR扩增、凝胶电泳、成像分析、目的片段测序等步骤研究Isl1基因在成年小鼠内能否进行敲除，从而为二型糖尿病发病机制的研究提供数据参考。

实验材料与方法

2。1实验材料

2。1。1实验试剂                                                                           

实验使用的主要药品及生产厂家如下：

试剂 生产厂商

Premix Ex Taq 杭州诺扬生物技术

Tris 杭州诺扬生物技术

TE（Tris、EDTA） 杭州诺扬生物技术

TAE（Tris、EDTA、NaOAC） 杭州诺扬生物技术