利用CRISPR/Cas9技术定点突变拟南芥CRWN3基因(3)
去离子水中，搅拌混匀，用 NaOH调pH到8.0 后定容至1 L，分装后高压灭菌。
（5）DNA提取缓冲液：分别取 100 mL 1 M Tris-Cl(pH 8.0) 溶液，40 mL0.5 M EDTA
(pH 8.0)溶液加入到约 500 mL的去离子水中，加入 81.8 g NaCl 固体，20 g CTAB，加热
搅拌，充分溶解后定容至 1 L，分装高压灭菌。
（6）TAE电泳缓冲液(50×，1 L)：取 242 g Tris 和37.2 g Na2EDTA·2 H2O加入约
600 mL去离子水中，充分溶解后，加入 57.1 mL冰醋酸，定容至 1 L。
（7）DNA上样缓冲液(1 L)：称取固体 Na2EDTA·2 H2O 11.23g后加入约 400 mL去
离子水中，加热0.5 g溴酚蓝搅拌至充分溶解后，加入 360 mL甘油并用 2 M NaOH调
pH到7.0 后定容至 1 L，室温保存。
（8）10×PCR buffer(50 mL)：将20 mL的1 M Tris-Cl(pH 8.0)溶液，将其 pH到调
8.4，取其中 10 mL放入25 mL去离子水中，加入 1.864 g KCl 和 0.203 g MgCl2·6H2O，
溶解后定容至50 mL，高压灭菌，4 ℃保存。
1．2 实验方法
1．2．1 植物材料的培养
（1）种子的消毒与幼苗的培养
首先将拟南芥Col-0种子里面的杂质去除干净，然后用8 % NaClO消毒拟南芥种子,
消毒的过程中可用涡旋震荡仪使其充分消毒，8 min后在超净台里用无菌水清洗，之后
可在MS 培养基上点种，点种完毕后用医用胶带封口置于 4 ℃冰箱，2 d后放入人工智
能气候室中培养，培养条件为 16 h光照/8 h黑暗、100 Μm-2
S-1
光照强度、恒温 22 ℃及
70-80 %的相对湿度。
（2）材料的种植
将培养皿中生长 10-14 d的幼苗移到装有已灭菌的营养土中，每小盆移 9株苗，之
后用保鲜膜覆盖，于 18-22 ℃、16 h光照/8 h黑暗和100 Μm-2
S-1
光照强度的人工智能
气候室中培养，4-5 d后可以将保鲜膜去掉，使植物正常生长。
1．2．2 设计sg RNA
设计 sg RNA的方法如下：
（1）在tair网站（拟南芥资源信息网站）寻找并下载拟南芥 CRWN3 基因序列；
（2）在 snapgene 中打开（1）所下载的 CRWN3 基因序列，标出该基因外显子与内含子；
（3）使用 snapgene 选择合适的sg RNA,合适的sg RNA应满足以下条件：序列满足
G+19N+NGG；序列 NGG前面2-8个bp 有酶切位点，且酶切位点所需用的酶为常用酶，
酶切范围越大越好（本课题采用的常用酶为HindⅢ） ；sg RNA越靠近起始密码子越好。
1．2．3 构建载体
（1）在 sg RNA 识别序列（不含有 PAM序列）加上用于构建克隆的接头列（针对
本体系用的AtU6 启动子，此处我们在有义链 5’ 端加上5’-GATT-3’接头，在无义链 5’
端加上5’-CAAA-3’接头），合成引物。将合成的正反向引物退火形成含有粘性末端接头
的双链核苷酸，退火体系为：
oligo 1 (10 µM) 5 uL
oligo 2 (10 µM) 5 uL
10 ul total
使用以下参数在PCR仪中进行退火：
37 ℃ 30 min
95 ℃ 5 min
4 ℃ at the end
（2）按如下体系用 BbsI酶切骨架载体 AtU6-26SK：
cutsmart 2 uL
BbsⅠ 1 uL
质粒 8 uL
ddH2O 9 uL
37 ℃酶解 3 h
酶切产物经1 %琼脂糖电泳后，采用Axygen公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，
参照试剂盒说明书回收片段：
①取 1.5 mL 离心管，称重，标记；用干净的小刀在紫外等下切割尽量小的含有目
的DNA的胶块，放入离心管中，再次称重，求得胶块净重；