摘 要：在利用里氏木霉降解纤维素为葡萄糖继而发酵生产液体燃料和通用化学品的工业生产过程中，降解纤维素到葡萄糖是关键的一步。β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的酶活及其表达时又起到至关重要的双重作用,然而其作用机理有待于进一步研究。为了提高里氏木霉产纤维素酶的水平，并为下一步研究β-葡萄糖苷酶cel1b的过量表达对里氏木霉纤维素酶的表达及其酶活的影响，本实验选择研究β-葡萄糖苷酶cel1b的克隆，通过克隆使得β-葡萄糖苷酶cel1b在里氏木霉胞内有效表达。有利于解决目前利用秸秆等木质纤维素废弃物生产液体燃料和通用化学药品生产过程中的瓶颈问题,更好的通过分子手段改造里氏木霉，提高里氏木霉产纤维素酶的水平。73728

毕业论文关键词：纤维素酶,β-葡萄糖苷酶cel1b,基因克隆

Abstract: Degradation of cellulose to glucose is the most crucial step in the industrial production of liquid fuels and bulk chemicals from cellulose by degrading cellulose to fermentable glucose using Trichoderma reesei。 β-glucosidase play a crucial dual role in regulating the expression and activity of cellulase, but its mechanism need further researches。 In order to improve the expression level of cellulase form Trichoderma reesei, and to study howβ-glucosidase cel1b affects the expression and activity of cellulase in Trichoderma reesei, this thesis successfully cloned β-glucosidase cel1b from Trichoderma reesei, which makes β-glycosidase cel1b express effectively inside the cell。 This helps to solved the bottleneck problem of using straw lignocellulose wastes to produce liquid fuels and common chemicals using genetic methods, and to improve the expression level of cellulase in Trichoderma reesei。

Keywords：cellulase,β-glycosidase enzymes cel1b,clone

目录

1 前言 6

2 实验材料 7

2。1 菌种与载体 7

2。2 试剂及主要培养基 7

2。3 菌种与载体的准备 7

3 实验方法 8

3。1 cel1b和β-act的启动子(Pact)扩增的引物设计 8

3。2 cel1b和Pact的PCR扩增 8

3。2。1 cel1b的PCR扩增 8

3。2。2 Pact的PCR扩增 9

3。3 cel1b和Pact的连接(重叠PCR) 10

3。4 Pact-cel1b片段与质粒（pCAMBIA1300）重组 10

3。5 将重组子导入大肠杆菌感受态细胞 11

4 重组子的转化鉴定 11

5 实验结果与分析 13

5。1 cel1b的PCR扩增 13

5。2 Pact的PCR扩增 14

5。3 cel1b和Pact连接(重叠PCR) 15

5。4 重组子的连接 15

5。5 重组子的转化与鉴定 16

结 论 18

参 考 文 献 19

致 谢 20

1 前言

β-葡萄糖苷酶是纤维素降解酶系重要组分之一，可以降解连接在末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，并且释放出β-D-葡萄糖和相应的配基[1]。在纤维素的糖基化作用下，β-葡萄糖苷酶可以将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖，而纤维素是地球上分布最广泛、含量最丰富的碳水化合物,占整个地球植物总干重的30%-50%[2]，在矿物燃料日渐枯竭，环境日渐恶化的严峻形势下，利用木质纤维素生产液体燃料和通用化学品，可以有效地缓解能源和环境问题，促进全球经济的可持续发展[3]。