摘 要:在利用里氏木霉降解纤维素为葡萄糖继而发酵生产液体燃料和大宗化学品的工业生产过程中，降解纤维素到葡萄糖是关键的一步。β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的酶活及其表达时又起到至关重要的双重作用。为了下一步研究β-葡萄糖苷酶cel3a在里氏木霉Rut C-30中对纤维素酶诱导表达及其酶活的影响，本实验研究是以里氏木霉的DNA为模板，设计扩增β-act的启动子和cel3a的引物，分别进行β-act的启动子和cel3a的PCR扩增，再利用重叠反应将两者连成一个片段Pact-cel3a，并将Pact-cel3a酶切后连接到pCAMBIA1300二元质粒上，用酶切和测序的方法确定cel3a克隆的成功。73225

毕业论文关键词：β-葡萄糖苷酶，里氏木霉，PCR扩增

Abstract:Degradation of cellulose to glucose is the most crucial step in producing liquid fuels and bulk chemicals from cellulose by degrading cellulose to fermentable glucose using Trichoderma reesei。 β-glucosidase play a crucial dual role in regulating the expression and activity of cellulase。 In order to further study how β-glucosidase cel3a affects the expression and activity of cellulase in Trichoderma reesei, this thesis successfully cloned β-glucosidase cel3a from Trichoderma reesei。 Gene cel3a and the promoter of actin were amplified using its genome DNA as template and gene specific primers, which were then connected by overlapping PCR。 The amplified fragment by PCR was then ligated to vector pCAMBIA1300。

Keywords:β-1,4-glucosidase, Trichoderma reesei, PCR

目录

1。 前言 5

1。1 里氏木霉及其纤维素酶组分 6

1。1。1 里氏木霉 6

1。1。2 纤维素酶 6

1。1。3 β-葡萄糖苷酶 7

2 材料与方法 8

2。1 实验材料 8

2。1。1 菌株与质粒 8

2。1。2 培养基 8

2。1。3 试剂 8

2。2 方法 8

2。2。1 克隆路线 8

2。2。2 引物设计 9

2。2。3 里氏木霉基因组DNA的提取 9

2。2。4 β-actin启动子的扩增 10

2。2。5 cel3a的扩增 10

2。2。6 琼脂糖凝胶回收DNA(exDNA导纳凝胶回收试剂盒) 10

2。2。7 β-actin的启动子和cel3a的片段的overlapping PCR 11

2。2。8 Pact-cel3a的片段的琼脂糖凝胶回收DNA 11

2。2。9 Pact-cel3a与pCAMBIA1300的连接 11

2。2。10 重组子的转化 13

2。2。11 转化子中的酶切检测 13

3 结果与分析 13

3。1 β-actin启动子的扩增及回收 13

3。2 cel3a的扩增及回收 14

3。3 Pact-cel3a的扩增 14

3。4 重组大肠杆菌表达载体pCAMBIA1300构建及鉴定 15

结论