降解纤维素生成葡萄糖的一组酶总称为纤维素酶，关键有外切-β-葡聚糖酶、内切-β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等三种组分。当纤维素水解时，想要提高纤维素水解效率，可通过增加β-葡萄糖苷酶活性[4]。目前研究纤维素酶的生产菌株，大部分实验采用纤维素酶系齐全和酶活力较高的木霉如绿色木霉（Trichoderma viride）和里氏木霉（Trichoderma reesei）等菌株[5]。在最常用的里氏木霉(T。 reesei)纤维素酶系中，即使外切-β-葡聚糖酶含量占总分泌酶蛋白的五分之三左右，内切-β-葡聚糖酶活力仍然不足，影响了纤维素酶对纤维素底物的协同降解效率。已经详细鉴定的β-葡萄糖苷酶现在有cel13a、cel1a、cel1b，当中里氏木霉胞外主要的β-葡聚糖酶是cel13a，另外两种都是胞内酶[5]。论文网

在利用里氏木霉降解纤维素为葡萄糖继而发酵生产液体燃料和通用化学品的工业生产过程中，降解纤维素到葡萄糖是关键的一步。β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的酶活及其表达时又起到至关重要的双重作用（如图1）。为了探索纤维素酶诱导表达过程当中，β-葡萄糖苷酶的作用机理，本实验选择研究β-葡萄糖苷酶cel1b的克隆，以便检验β-葡萄糖苷酶cel1b对里氏木霉纤维素酶活性的影响。

图1为β-葡萄糖苷酶对整体纤维素酶双重作用的关系示意图

许多实验研究表明，β-葡萄糖苷酶基因可在大肠杆菌中表达，国内有研究者从茶树中克隆到β-葡萄糖苷酶基因，并采用pET 载体在大肠杆菌中实现了表达[7],本实验选择克隆里氏木霉β-葡萄糖苷酶cel1b基因，与二元载体pCAMBIA1300[8]连接构成重组子，将重组子导入到大肠杆菌感受态细胞。实验目的就是通过分子手段更好的改造里氏木霉，使里氏木霉产纤维素酶的量提高，解决纤维素降解过程中的瓶颈。

2 实验材料

2。1 菌种与载体

大肠杆菌:选用Escherichia coli DH5α作为克隆宿主；里氏木霉菌QM9414；载体：选用一个含有T-DNA的二元质粒pCAMBIA-1300，Kanr，Hygr，购于美国真菌遗传学库存中心。

2。2 试剂及主要培养基

限制性内切酶XbaI和HindIII、T4 DNA Ligase、Taq DNA Polymerase、RNase、各种DNA Marker均购买于宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa），dNTPs购买于北京佳兰生物科技有限公司，PCR引物由赛百事基因技术有限公司合成，exDNA导纳凝胶回收试剂盒购买于淮安百惠公司，分子生物学试剂购买于TaKaRa、北京索莱宝科技有限公司等。PDA培养基、LB培养基配方见参考文献[9]。

2。3 菌种与载体的准备

（一）里氏木霉的培养

将里氏木霉在PDA平板上培养2天，收集里氏木霉菌丝存放冷冻箱中备用。

（二）二元质粒pCAMBIA1300的提取

1。大肠杆菌的培养

在无菌操作台内，用接种环蘸取大肠杆菌菌液，然后在LB培养基上划线，37℃培养。

2。二元质粒pCAMBIA1300的提取

实验前一天晚上，挑取大肠杆菌单菌落至含卡那霉素浓度为100µL/ml的LB培养基中，37℃振荡培养16h，将培养物转移至1。5ml离心管，以7000rpm/min的速度离心5min，吸走上清，将其倒扣在吸水纸上直到液体吸干。向沉淀中加入150µL预冷的SolutionⅠ，涡旋震荡充分混匀。向上述溶液中加入SolutionⅡ缓冲液（与SolutionⅠ等体积），慢慢颠倒使之混匀，（切勿剧烈振荡，避免DNA断裂），直至液体由浑浊变有点澄清，打开管盖发现有黏丝（注意：SolutionⅠ时间不要超过3min）。向上述溶液中加入200µL的Solution Ⅲ（轻柔加入）。同样慢慢颠倒混匀，可看见有鸡蛋清状的絮状沉淀，混匀后放于冰上5min。13000rpm/min离心10min，取上清至另一1。5ml的离心管（取上清时不要碰到漂浮固体以及管底的沉淀）。吸取到新离心管中的上清再13000rpm/min 离心10min。向干净的上清中加相同体积的异丙醇，混匀，-20℃沉降30mim。13000rpm/min离心 10min ，去上清，取沉淀，倒扣于吸水纸上晾干异丙醇。加入700µL 的75%乙醇，溶解DNA（洗去杂质），13000rpm/min 离心5mim，重复上一步骤，弃上清，空管离心，13000rpm/min离心1min，晾干剩余乙醇，每管中再加入30µL的1×TER，保存于4℃冰箱备用[10]。