2。4。2 华鳈cDNA制备

接着检测合格的RNA立即用于cDNA的合成。利用Trizol方法提取组织总RNA。cDNA第一链的合成使用HiFi-script cDNA第一链合成试剂盒内方法,以华鳈肌肉总RNA为模板, 以购自生工生物工程（上海）股份有限公司设计的为反转录引物,按试剂盒推荐方法进行操作。根据RNA的量建立20 ul的反应体系进行反转录，PCR 反应体系为25μL, PCR 反应程序为：变性42℃，50min；退火85 ℃，5 min；保存20 ℃,2 min。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却后开始华鳈cDNA的处理。从华鳈身上所取得的10样组织的CDNA管中每离心管取6 µl，放入同一个离心管中（共60 µl），再稀释10倍（取20 µl的混合物，再加入180 µl的灭菌超纯水）。

2。5 引物设计和PCR扩增

引物（见表1）购自生工生物工程（上海）股份有限公司设计提供。PCR反应体系为25 μL: 在离心管内加入180 µl灭菌超纯水，再加入mstn基因上下游引物各10 µl（共计200 µl），在离心管上写上该引物名字，震荡十几秒再离心几秒钟，即完成对引物的初步处理。剩下的上下游引物在-20 ℃的温度下保存。10× PCR缓冲液12。5 μL, 超纯灭菌水9。4 μL ，10×Buffer 1。25 µl， dNTP 0。4 μL,Taq DNA聚合酶0。1 μL,DNA模板1 μL,引物 0。4 μL。PCR 反应体系为 25 μL, PCR反应程序为：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性35 s；（52 ℃，54 ℃，55 ℃，56 ℃）（见图1）退火40 s；72 ℃延伸50 s,36个循环；最后72 ℃延伸5 min；20 ℃ 2 min保存，PCR 产物 1%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照，检测出DNA条带最适退火温度。

表1 华鳈MSTN引物

引物名称Primers 序列(5'—3')Sequences 产物长度(bp)

Products length 退火温度℃ Annealing temperature

SsmstnIn2 SsmstnIn2F CGACCACAGTCTTCTTACAG 361 53

SsmstnIn2R GTGAGAGGGTATCTACAGCAT

Ssmstn-1 Ssmstn-1F ACTGCGAAAGAAGTCCAGC 527 53

Ssmstn-1R TCCATCCTTACTGTCATCCC

Ssmstn-2 Ssmstn-2F TGACCCCATCGTTCAAGTAG 369 54

Ssmstn-2R AGTCCATCCTCTCCAGCCT

Ssmstn-3 Ssmstn-3F ATGCTGTAGATACCCTCTCAC 556 53

Ssmstn-3R TGTCGTCCATTTCAATAGTG

Ssmstn-4 Ssmstn-4F TCTGACGCAAACTTCCACAT 693 50

Ssmstn-4R GACAACACCCTTCATCCACC

 2。6 琼脂糖凝胶DNA回收文献综述

将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入干净的离心管（自备）中，称取重量。向胶块中加入3倍体积Buffer PG；当琼脂糖凝胶浓度＞2%时，建议使用5倍体积Buffer PG（如凝胶重为100 mg，其体积可视为100 µl，依此类推）。50 ℃孵育10分钟，其间每隔2-3分钟温和地上下颠倒离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟直至胶块完全溶解。向已装入收集管中的吸附柱（Spin Column DM）中加入200 µl Buffer PS，13,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将步骤3所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2分钟，13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。向吸附柱中加入750 µl Buffer PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。13,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。将吸附柱放到一个新的1。5ml离心管（自备）中，向吸附膜中间位置悬空滴加30 µl灭菌超纯水，室温放置2分钟。13,000 rpm离心1分钟，收集DNA溶液。-20 ℃保存DNA。其他按照Gel Extraction Kit 快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（康为世纪生物科技有限公司）注意事项进行实验操作。