同一个miRNA能够调控多个不同的mRNA,而不同的miRNA也能够对同一类mRNA起调控作用。有预测数据表明,人类细胞中约有1/3能够编码蛋白质的基因都受到miRNA分子的调控。miRNA分子在其表达过程中,表现时序性、进化过程中高度保守性及组织特异性等特征[2]。研究发现它在一定程度上能够调控细胞增殖分化及凋亡、细胞进化、胚胎发育、血管形成、肿瘤发生等很多生理及病理的基本过程。
miR-210的位置处于人类第11号染色体上,其表达产物存在于各种细胞中。近几年有研究结果表明,miR-210在缺血低氧性损伤、线粒体的呼吸作用、新生血管形成、肿瘤发生等过程中都能够发挥一定作用[3]。miR-210表达上调与多种肿瘤的不良预后有关,例如胃癌、肺癌、肾癌及乳腺癌,且miR-210在肿瘤中的过表达是微环境处于低氧状态的直接结果[4-9]。所以,对miR-210展开全面研究可能有利于疾病诊断,以及缺血性相关疾病和肿瘤的治疗。
1  材料与方法
1.1  实验材料
1.1.1  HEK293细胞和HEK293T细胞(生工)
HEK293细胞是一种转染了腺病毒E1A基因的人体肾脏上皮细胞系,而HEK293T细胞则是由HEK293细胞派生而出,同时表达SV40大T抗原、含有SV40复制起始点和启动子区的质粒可以进行复制,蛋白表达水平高,有利于高效率转染的便携载体[10]。
1.1.2  pIRESneo-FLAG-HA-Ago2质粒
Argonaute(Ago)蛋白广泛存在于各种生物体内,是一类相对分子质量大约为105的的碱性蛋白家族,且具有高度保守的结构。这个蛋白家族中,只有Ago2蛋白是RNA诱导沉默复合体(RISC)的重要成分,具有核酸内切酶活性,可以通过与miRNA相结合而调节成熟miRNAs的活性,参与mRNA的基因沉默过程,进而影响细胞的一系列生物学活性[11]。293T细胞瞬时转染pIRESneo-FLAG-HA-Ago2后能过表达Ago2蛋白。
1.2  实验方法
1.2.1  细胞传代
待细胞融合程度达到90%以上后,进行细胞传代。用移液枪吸走所有培养基,加入1ml含有10% FBS的新鲜高糖DMEM培养基洗涤细胞后弃去培养基,再加1ml 0.05%胰酶消化细胞,在显微镜下观察细胞开始变圆,有少量细胞开始脱离培养皿底部时,向培养皿中加入14ml含有FBS的新鲜高糖DMEM培养基将皿底细胞全部洗下,吹吸混匀后向6孔板的每个孔中转移2ml细胞悬液。培养皿中剩余2ml细胞悬液,补加10ml新鲜培养基并混匀后,放入37℃、5% CO2恒温培养箱中继续培养[12]。
1.2.2  细胞转染
在6孔板中进行细胞转染,共设置3种处理,分别标记为0组、1组和2组。0组作阴性对照,1组将pIRESneo-FLAG-HA-Ago2质粒与对照RNA(NC)各1μg共转染入293T细胞,2组将pIRESneo-FLAG-HA-Ago2质粒与miR-210各1μg共转染入293T细胞[13]。
待6孔板中已分好的细胞大多贴壁且细胞密度为70%~80%时进行转染,取100μl无血清培养基与共转染质粒混匀,同时取5μl转染试剂lipofectamine 2000与100μl无血清培养基混匀,然后将二者混合,配好后在常温下静置15~20min,最后慢慢逐滴将转染体系加入6孔板的各孔中。镜检观察后将6孔板放入37℃、5% CO2恒温培养箱中转染48h。
1.2.3  免疫共沉淀(Co-IP)
转染48h后,弃去6孔板中的培养基,用PBS轻轻洗涤细胞两遍。向各孔中分别加入200μl由1.3ml NETN、1.3μl DTT和1μl RNasin配成的混合液,将孔壁上的细胞全部洗下后按组分别转移至新的1.5ml EP管中。4℃、14000rpm下离心10min,各处理组分别取10μl上清液,每管加入3.5μl 4×SDS loading buffer混匀后留做总蛋白测定。
其余上清液分别转移至新的EP管中进行Co-IP实验,每管加入5~8μl已用NETN洗涤一遍的FLAG Ab beads,置于翻转式摇床中于4℃孵育60min。4000rpm离心1min后弃上清,再用0.4ml NETN洗涤beads 4次,最后1次加入0.4ml NETN后充分混匀。
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