miR-210的靶基因鉴定与分析(2)
同一个miRNA能够调控多个不同的mRNA，而不同的miRNA也能够对同一类mRNA起调控作用。有预测数据表明，人类细胞中约有1/3能够编码蛋白质的基因都受到miRNA分子的调控。miRNA分子在其表达过程中，表现时序性、进化过程中高度保守性及组织特异性等特征[2]。研究发现它在一定程度上能够调控细胞增殖分化及凋亡、细胞进化、胚胎发育、血管形成、肿瘤发生等很多生理及病理的基本过程。
miR-210的位置处于人类第11号染色体上，其表达产物存在于各种细胞中。近几年有研究结果表明，miR-210在缺血低氧性损伤、线粒体的呼吸作用、新生血管形成、肿瘤发生等过程中都能够发挥一定作用[3]。miR-210表达上调与多种肿瘤的不良预后有关，例如胃癌、肺癌、肾癌及乳腺癌，且miR-210在肿瘤中的过表达是微环境处于低氧状态的直接结果[4-9]。所以，对miR-210展开全面研究可能有利于疾病诊断，以及缺血性相关疾病和肿瘤的治疗。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 HEK293细胞和HEK293T细胞（生工）
HEK293细胞是一种转染了腺病毒E1A基因的人体肾脏上皮细胞系，而HEK293T细胞则是由HEK293细胞派生而出，同时表达SV40大T抗原、含有SV40复制起始点和启动子区的质粒可以进行复制，蛋白表达水平高，有利于高效率转染的便携载体[10]。
1.1.2 pIRESneo-FLAG-HA-Ago2质粒
Argonaute(Ago)蛋白广泛存在于各种生物体内，是一类相对分子质量大约为105的的碱性蛋白家族，且具有高度保守的结构。这个蛋白家族中，只有Ago2蛋白是RNA诱导沉默复合体(RISC)的重要成分，具有核酸内切酶活性，可以通过与miRNA相结合而调节成熟miRNAs的活性，参与mRNA的基因沉默过程，进而影响细胞的一系列生物学活性[11]。293T细胞瞬时转染pIRESneo-FLAG-HA-Ago2后能过表达Ago2蛋白。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞传代
待细胞融合程度达到90%以上后，进行细胞传代。用移液枪吸走所有培养基，加入1ml含有10% FBS的新鲜高糖DMEM培养基洗涤细胞后弃去培养基，再加1ml 0.05%胰酶消化细胞，在显微镜下观察细胞开始变圆，有少量细胞开始脱离培养皿底部时，向培养皿中加入14ml含有FBS的新鲜高糖DMEM培养基将皿底细胞全部洗下，吹吸混匀后向6孔板的每个孔中转移2ml细胞悬液。培养皿中剩余2ml细胞悬液，补加10ml新鲜培养基并混匀后，放入37℃、5% CO2恒温培养箱中继续培养[12]。
1.2.2 细胞转染
在6孔板中进行细胞转染，共设置3种处理，分别标记为0组、1组和2组。0组作阴性对照，1组将pIRESneo-FLAG-HA-Ago2质粒与对照RNA（NC）各1μg共转染入293T细胞，2组将pIRESneo-FLAG-HA-Ago2质粒与miR-210各1μg共转染入293T细胞[13]。
待6孔板中已分好的细胞大多贴壁且细胞密度为70%~80%时进行转染，取100μl无血清培养基与共转染质粒混匀，同时取5μl转染试剂lipofectamine 2000与100μl无血清培养基混匀，然后将二者混合，配好后在常温下静置15~20min，最后慢慢逐滴将转染体系加入6孔板的各孔中。镜检观察后将6孔板放入37℃、5% CO2恒温培养箱中转染48h。
1.2.3 免疫共沉淀（Co-IP）
转染48h后，弃去6孔板中的培养基，用PBS轻轻洗涤细胞两遍。向各孔中分别加入200μl由1.3ml NETN、1.3μl DTT和1μl RNasin配成的混合液，将孔壁上的细胞全部洗下后按组分别转移至新的1.5ml EP管中。4℃、14000rpm下离心10min，各处理组分别取10μl上清液，每管加入3.5μl 4×SDS loading buffer混匀后留做总蛋白测定。
其余上清液分别转移至新的EP管中进行Co-IP实验，每管加入5~8μl已用NETN洗涤一遍的FLAG Ab beads，置于翻转式摇床中于4℃孵育60min。4000rpm离心1min后弃上清，再用0.4ml NETN洗涤beads 4次，最后1次加入0.4ml NETN后充分混匀。