图 1-2 白藜芦醇生物合成途径示意图

Fig. 1-2 The schematic diagram of the resveratrol biosynthetic pathways

① 以苯丙氨酸为底物合成途径 代谢过程如下：

第一步，苯丙氨酸在苯丙氨酸氨解酶的催化下产生反式肉桂酸； 第二步，反式肉桂酸经肉桂酸-4-羟化酶（C4H）的催化，生成对香豆酸； 第三步，对香豆酸在对香豆酸辅酶 A 连接酶的催化下转化为对香豆酸辅酶 A； 第四步，白藜芦醇在白藜芦醇合成酶的催化下由底物生成。

② 以酪氨酸为底物合成途径 代谢过程如下：

第一步，酪氨酸在酪氨酸解氨酶（TAL）的催化下生成对香豆酸； 第二步，对香豆酸在对香豆酸辅酶 A 连接酶的催化作用下转化为对香豆酸辅酶A；第三步，白藜芦醇合酶（RS）催化一分子对香豆酸辅酶 A 和三分子丙二酸单酰辅酶 A 生成白藜芦醇。 从以上两条合成途径可以看出：对香豆酸是合成白藜芦醇的必然中间产物，而酶 4CL 和 RS 是两条途径中的必须酶。因此，在构建合成白藜芦醇的重组质粒时， 对香豆酸辅酶 A 连接酶基因和白藜芦醇合成酶基因是我们研究的重点和必须导入 的对象。因为这两种基因表达合成的酶是合成白藜芦醇的关键酶。

（2）白藜芦醇的制备方法 白藜芦醇是二苯烯衍生物，已经从多类植物中发现并提取出来[28]。生产方法主要分为化学法，植物提取法，植物细胞法，微生物发酵法等。每种方法存在各自的 优点以及缺陷，由于白藜芦醇在植物中广泛存在，以及其它生产和提取方法并不能 达到预期目标，因此植物提取法依然是主要提取方法，但不可忽略的是，微生物共 培养的方法已经得到越来越多的关注。

① 化学法

白藜芦醇是一种分子结构较为简单小分子物质，因此化学法不失为一种可行的 方法。主要的优点便是提取简单，成本较低。但缺点亦相当明显，主要表现在提取 过程中污染较严重，而且提取的原料容易受到环境，季节的限制，且提取过程中容 易形成消旋体，造成成本的极大浪费。

② 植物提取法

由于白藜芦醇在多种植物中发现，且有的植物中含量较高，因此，植物提取法 相对比较简单且传统，原料比较充分，且提取方式多样，如溶剂提取，超声波辅助 提取，超临界二氧化碳萃取以及酶法提取等。选择的方式多样，可以根据自身需要 选择不同提取方法，既方便成本又不是特别高。但是，植物的生长周期往往较短， 收季节和环境的影响也比较大，另外，在使用有机溶剂是容易造成污染。

③ 植物细胞法

比较先进的一种提取技术，通过细胞培养的方法，得到所需要的产品。且不会 受到季节的限制，可以同时获得白藜芦醇及其相应的衍生物，也不需要大规模的生 物工程改造。但细胞培养所需的底物原料等价格都比较昂贵，提取代价比较大。

④ 微生物发酵法 这是一种新型的获取目的产品的方法，可以根据不同的需求构建不同的重组菌株，通过培养或发酵等方式最终得到白藜芦醇。此方法根据选取的菌种不同决定了 提取方式的不同，但生产周期都相对较短，产生的白藜芦醇与在利用植物法提取的 白藜芦醇完全相同且成本较低，不需要付出相对较高的生产成本。但是，这种方法 需要构建教复杂的代谢途径，而且产品的产量比较低，多用于研究用途，不适用于 工业上的大规模生产，此外，还有很多方面对技术和操作要求比较高。

1.2 主要研究内容和研究目的

1.2.1 主要研究内容

近年来，微生物构建重组质粒异源表达生产白藜芦醇一直是研究热点。因为此 研究一方面能够解决环境和地域对植物造成的影响，同时还能减少化学生产产生的 污染和危害。而且对于目的基因 RS 的研究已经相当成熟，但都是基于比较传统的 植物，如葡萄，花生，虎杖等。而对于桑葚中白藜芦醇基因的研究几乎没有涉及， 桑葚作为生活中比较常见的一种植物果实，具有可食用，无毒无害，无副作用等一 系列优点，因此，本实验中的白藜芦醇基因，来自常见的植物果实桑葚，通过基因 扩增并导入表达载体实现异源表达。而在微生物的选用方面选取了最常见的且表达 稳定的酵母菌，以对香豆酸为底物，导入 RS3 和 4CL 基因，表达产物更加稳定， 产率更高。