利用厌氧真菌和甲烷菌共培养体系研究三硝酸丙酸酯对厌氧真菌代谢的影响(2)
链脂肪酸和多不饱和脂肪酸会影响饲料降解率；2）苹果酸和富马酸使用成本过高；3）植物次级代谢物长期使用抑制瘤胃CH4的效力减弱；4）卤代CH4类似物会影响动物健康；5）抗生素离子载体已被禁止添加到饲料中；6）筛选产CH4较低的动物品种周期较长，成本较高；7）除去原虫会影响瘤胃正常发酵。
最近含有硝酸酯（-O-NO2）官能团的一类化合物，因能够有效抑制甲烷的产量，成为研究的热点。研究表明通过对甲基辅酶M（CH3-S-CoM）还原酶的特异性抑制，能降低瘤胃甲烷的产生。3-硝酸酯丙醇（3-nitrooxypropanol，3-NOP）是甲基辅酶M的类似物，其不仅能能够竞争底物结合位点，同时能够氧化MCR的活性中心位点使其由Ni（I）变为Ni（II）[11]，阻断甲烷的合成。最近的体内和体外研究表明，其能有效地控制瘤胃甲烷的产生，硝酸酯化合物除硝酸酯（-O-NO2）基团具有氧化性外，其还原产物亚硝酸盐也具有氧化甲基辅酶M的能力，因此在这种双重作用机制下，微量的硝酸酯化合物就能够有效抑制瘤胃甲烷的产生，具有较强的应用前景。
硝酸酯化合物对瘤胃甲烷的生成有较好的抑制效果，但对瘤胃重要的纤文降解菌厌氧真菌的影响尚不知晓，因此本课题利用厌氧真菌和甲烷菌体外共培养法研究了硝酸酯化合物NG对瘤胃厌氧真菌和甲烷菌代谢的影响，旨在为NG在反刍动物生产上的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 研究材料
NG购自北京益民药业有限公司。
接种来源于南京农业大学消化道微生物研究室: Piromyces sp. F1和Methanobrevibacter sp.。
1.2 试验方案
试验设立真菌纯培养组：分别添加NG 0、6.6、13.2、19.8 μm/L；真菌和甲烷菌共培养组：分别添加NG 0、6.6、13.2、19.8 μm/L。39℃静止发酵96 h。
培养基参照Theodorou等[12]的方法配置，由缓冲液、基础培养基、无细胞瘤胃液、还原剂和氧化还原指示剂组成。厌氧培养基配置完成后，分装到160 mL的发酵瓶中，每瓶装95 mL培养基。底物为1 g 粉碎稻草（长度约1 mm）。接种物为培养三天的厌氧真菌纯培养物和共培养物，接种量约为5 mL菌液。接种前根据真菌ITS基因拷贝数调节真菌纯培养和共培养液中的真菌浓度。
1.3化学分析
发酵结束后，立即测定总产气量、甲烷、氢气和pH。总产气量的测定参照Theodorou等[12]的方法，利用数字显示pH计（Ecoscan pH 5 Singapore）测定pH值。
挥发性脂肪酸浓度检测参照Pontes等13]的方法。
乳酸参照Barker & Summerson[14]方法测定。
1.4微生物定量测定
DNA提取参照Martínez-Fernández等[15]的方法。
微生物浓度定量分析采用SYBR® Premix Ex TagTM（TaKaRa）试剂和Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System，对发酵液中真菌和甲烷菌浓度
进行定量。
表1 本研究使用PCR引物序列
Table 1 PCR primers used in this study
Target organisms Sequence (5'—3') Annealing
temperature (℃) Product
size (bp) Reference
Archaea GTGCTCCCCCGCCAATTCCT 59 471 [11]
GCGGTGTGTGCAAGGAGC
Anaerobic fungi GAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAG 60 120 [13]
GTTTCCAAATTCACAAAGGGTAGGATGA TT
1.5 数据统计
数据经Excel 2007初步整理后采用SPSS 20.0软件中的One-way ANOVA(Turke)进行分析，置信区间为95%。
2 结果分析