黄萎病菌侵染下抗感黄萎病棉花品种微管变化规律分析(2)
1.实验部分
1.1 实验所用仪器及试剂
仪器：刀片 ； PDA 平板 ； 摇床 ； 离心机 ；血球计数板 ；
塑料盒 ； 激光共聚焦显微镜 ；接种环 ；冷冻切片机
试剂：大丽轮枝菌；查氏培养液 ；蒸馏水
1.2 实验所用材料
实验所用材料为感病棉花种子冀棉11和抗病棉花种子海岛棉7124，分别在玻璃温室中进行土培盆栽培养，选取第10真叶的主茎叶片（叶龄22天左右）为研究对象。
1.3 实验过程
（1）利用叶片外植体培养：用锋利刀片，将实验材料沿叶柄基部切下叶片,稍加修剪后水培；待叶柄长出根（长度5厘米）时，进行黄萎病侵染处理；
（2）制备孢子悬浮液： 将放在-80℃保存的菌株，用PDA 平板活化3-4 d之 后，经过活化之后用接种环挑取菌块放入查氏培养液中,并将培养液放入25℃ , 220 r.min-1 的摇床上摇培5-6 d,经摇培之后再将培养液过滤, 并取5000g滤液放置在离心机中离心5 min, 弃上清液,用清水稀释孢子沉淀, 用血球计数板进行计数, 计数之后再将培养液浓度调至1×107 个孢子.mL-1；
（3）接种：将调好浓度的孢子悬浮液加入空塑料盒中, 将叶片外植体培养的抗感病棉花的根浸根40 min，在浸根40 min按照一定操作进行接种；
（4）接种后处理：将接种之后的叶片外植体转回至蒸馏水中25℃光照16 h,每盒种12 株苗。对照棉苗用清水浸泡40 min。于处理后0h,2h,4h,6h,8h 切下根尖（长度1厘米），进行微管的固定，冰冻切片，免疫染色。于激光共聚焦显微镜下观察并照相。
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