大肠杆菌乳糖通透酶基因LacY的敲除(2)
4.2.10 将线性化DNA片段作为模板进行PCR扩增 23
4.2.11 电转化 24
5 实验结论与总结 25
致 谢 26
参考文献 27
1绪论
1.1 大肠杆菌乳糖通透酶LacY基因与乳糖操纵子
乳糖操纵子是参与乳糖分解的一个基因群[1]，由乳糖系统的阻遏物和操纵序列组成，使得一组与乳糖代谢相关的基因受到同步的调控。1961年雅各布（F．Jacob）和莫诺德（J．Monod）根据对该系统的研究而提出了著名的操纵子学说。在大肠杆菌的乳糖系统操纵子中，β-半乳糖苷酶，半乳糖苷渗透酶，半乳糖苷转酰酶的结构基因以LacZ（z）， Lac Y（y），Lac A（a）的顺序分别排列在染色体上，在z的上游有操纵序列Lac O（o），更前面有启动子Lac P（p），这就是操纵子（乳糖操纵子）的结构模式。编码乳糖操纵系统中阻遏物的调节基因Lac I（i）位于和p上游的临近位置。
细菌相关功能的结构基因常连在一起，形成一个基因簇。它们编码同一个代谢途径中的不同的酶。一个基因簇受到同一的调控，一开俱开，一闭俱闭。也就是说它们形成了一个被调控的单位，其它的相关功能的基因也包括在这个调控单位中，例如编码透过酶的基因，虽它的产物不直接参与催化代谢，但它可以使小分子底物转运到细胞中。
乳糖分解代谢相关的三个基因，lacZ、Y、A就是很典型的是上述基因簇[2]。它们的产物可催化乳糖的分解，产生葡萄糖和半乳糖。它们具有顺式作用调节元件和与之对应的反式作用调节因子。三个结构基因图的功能是：
lacZ编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），此酶由500kd的四聚体构成，它可以切断乳糖的半乳糖苷键，而产生半乳糖和葡萄糖
lacY编码β一半乳糖苷透性酶(galactoside permease)，这种酶是一种分子量为30kDd膜结合蛋白，它构成转运系统，将半乳糖苷运入到细胞中。
lacA编码β-硫代半乳糖苷转乙酰基酶（thiogalactoside transacetylase），其功能只将乙酰-辅酶A上的乙酰基转移到β-半乳糖苷上。
无论是lacZ发生突变还是lacY发生突变却可以产生lac-型表型，这种lac-表型的细胞不能利用乳糖。 lacZ-突变体中半乳糖苷酶失去活性，直接阻止了乳糖的代谢。lacY-突变体不能从膜上吸取乳糖。
这一个完整的调节系统包括结构基因和控制这些基因表达的元件，形成了一个共同的调节单位，这种调节单位就称为操纵子（opron）。操纵子的活性是由调节基因控制的，调节基因的产物可以和操纵子上的顺式作用控制元件相互作用。
lacZ、Y、A基因的转录是由lacI基因指令合成的阻遏蛋白所控制。lacI一般和结构基因相毗连，但它本身具有自己的启动子和终止子，成为独立的转录单位。由于lacI的产物是可溶性蛋白，按照理说是无需位于结构基因[3]的附近。
1.2 Red重组系统及在微生物基因敲除中的应用
Red/ET重组是新近出现的一种基于λ噬菌体Red操纵子（Redα/Redβ/Redγ）和Rac噬菌体RecE/RecT重组系统的DNA工程技术。
通过该技术可以简单、快速地对任意大的DNA分子进行插入、敲除、突变等多种修饰，而且还可对长达80kb的DNA片段进行亚克隆。由于重组反应的整个过程都是在大肠杆菌细胞内部完成，因此不存在碱基突变危险。该技术已被广泛地用于基因组DNA，如细菌人工染色体、大肠杆菌染色体等的遗传修饰研究以及基因工程药物的研究和开发中。
Ellis、Court和Stewart等研究发现在Red系统的bet基 因作用下可以启动E.coli染色体和短的单链寡核苷酸序列间发生重组,导致基因的敲除或置换[4]。因此目前广泛用于原核生物的基因敲除。Red重组技术就是利用整合到细菌染色体上或质粒中的Red系统编码的Red重组酶来实现外源PCR片段与基因组中靶基因的同源重组。λRed区段包括3个基因:bet、exo和 gam[5] 。Exo是5′→3′核酸外切酶,能降解线性DNA的5′末端,产生3!游离的DNA片段。bet基因编码的β蛋白是一个单链DNA结合蛋白,它可以结合到由Exo产生的单链DNA的3′端,从而启动互 补DNA链的退火,引发DNA链的交换反应。β蛋白还可与Exo外切核酸酶形成复合体,调节核酸溶解和重组启动。gam基因的表达产物Gam蛋白与宿主的RecBCD复合体结合并抑制宿主外切核酸酶活性,阻 止外源线性DNA片段被降解[6] 。它们共同作用介导了外源线性DNA片段与细菌染色体靶基因进行同源重组,外源线性DNA通常是PCR产物、寡核苷酸片段等,在它们的两端各含有与染色体靶基因两端同源的40～60bp序列。这种Red重组技术省去了体外DNA酶切、连接等步骤,使细菌染色体靶基因的敲除与替换操作相对简单,逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。