新分离H9N2亚型禽流感HA、NA基因的测序分析及其免疫学实验研究(2)
2.7 T淋巴细胞亚型检测 15
2.8树突状细胞检测 16
2.9小鼠脾脏淋巴细胞增殖16 结论与讨论 17
参考文献 18
致谢 19
新分离H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA基因测序分析及其免疫实验研究
禽流感（Avian influenza,AI）是因为禽类、鸟类、以及部分哺乳类感染了正黏病毒科A型流感病毒属禽流感病毒引起的急性传染病[1]。禽流感病毒的病毒亚型众多，根据病毒表面糖蛋白HA的抗原性（H1-H18）和NA的抗原性（N1-N11）进行分类。一种亚型所产生的抗体只对同种亚型病毒有抑制作用，但对不同亚型的病毒没有作用[2-4]。我们在预防和治疗禽流感病的工作上就造成了很大的困难。而且现实中人们对高致病性的亚型如H5N1研究分析比较透彻，控制的也比较好，但是对H9N2这种低毒力的禽流感研究的很少，人们关注度也不是很高[5-7]。但是在禽类养殖中，H9N2这种亚型对禽类养殖业带来的损失才是最大的，而且目前发现这种病毒不仅引起禽类的上呼吸道感染，而且有些毒株还可以感染给人，所以对H9N2亚型的研究就显得极其重要，具有很重要的公共卫生学意义。
流感的致病性主要是由HA基因决定。因为HA是负责识别宿主细胞的受体，并且与宿主细胞受体结合，HA的受体蛋白每个种属都有其特异性，所以就决定不同的亚型感染不同的种。其次，病毒基因是否能够进入细胞还依赖细胞转运蛋白水解酶的切割，使HA的N端暴露，这样才能和细胞膜融合，从而进入细胞里。其中高致病性禽流感的肽段比较长，且还有多个碱性基团，很容易被多器官的水解酶识别，从而更容易暴露N端，使核酸进出细胞，高致病性禽流感一旦发生感染，可同时侵害多个器官，使身体多个器官发生病变。可见HA蛋白的水解能力的大小，决定了禽流感病毒致病能力的大小。除HA外，NA等其他基因也影响宿主细胞对病毒颗粒的识别，所以禽流感的致病力大小，是多个基因共同作用的结果。
H9N2和H5N1病毒在许多国家的活禽市场都大量被分离出来，家禽和野生鸟中都被报道出同时有低致病性禽流感H9N2和高致病性禽流感H5N1的感染。已经存在的异型免疫可以保护不同种的动物免受H5N1的侵害。有研究表明预先暴露在H9N2这种低致病性禽流感的加拿大鹅患病率和死亡率都明显低于未暴露的加拿大鹅。H5N1和H9N2的共同传播可以产生新的流感病毒危害人们的健康。
细胞毒T淋巴细胞可以通过MHC介导方式杀死已经感染病毒的细胞。细胞毒T淋巴细胞可以直接对内部蛋白，核蛋白（NP），聚合酶（PB1和PB2和PA）,基质蛋白（M1）和非结构蛋白（NS1）在人和老鼠中已经被发现。
NS1和A型流感病毒HA2亚型的病毒也可以诱导小鼠的交叉反应性细胞毒T细胞的反应。给幼鸡注射感染H9N2的鸡的CD8 T细胞可以对H5N1病毒免疫。H5N1高致病性禽流感在2006年爆发之后，以后的每年全世界都有关于H5N1爆发的报道。有着PB1-H9N2基因的H5N1的重组病毒在孟加拉国和印度多个地区已经分离得到。经过分析这种病毒可能来自香港，H9N2和H5N1共同感染在印度已经被报道。对H5N1的免疫也取决于之前感染的禽流感的亚型
所以对H9N2的研究显得至关重要，它不仅对H9N2这一种亚型的感染的防治工作有意义，也对防治H5N1这种高致病性流感病毒有意义，还对研究禽流感病毒的变异进化有重要意义。
HA和NA基因的突变主要是有两种类型：一种是抗原漂移，这种突变比较的缓慢，另一种是抗原转换，这种变异比较危险，因为它可以将原来不传给人的病传给人[9-11]。
本实验对H9N2亚型的AIV的HA，NA基因进行测序，并对基因进行二级结构的分析，以及找到基因的同源基因，做基因进化的分析，并将该新分离H9N2禽流感病毒灭活乳化后免疫小鼠，开展疫苗免疫效果研究，为H9N2的防治工作提供理论依据。