反刍动物瘤胃不同相核心微生物菌群分析(2)
反刍动物的瘤胃作为高效降解纤文素的天然反应器，随着人们对瘤胃微生物多样性方面的研究逐渐深入，目前的研究手段已经从传统依赖分离培养瘤胃中获得细菌，发展到利用宏基因组/基因组学技术，直接从瘤胃中获得大量新的微生物菌群基因/基因簇，直接通过高通量分析瘤胃菌群整体的基因结构，探讨菌群结构对反刍动物纤文降解的分子机理[4]。目前，瘤胃核心细菌菌群结构研究方式有，①宏基因组学（Metagenomics）又叫元基因组学、微生物环境基因组学。1998 年，Jo Handelsman 首次提出了宏基因组学的概念[5]。它通过从环境样品中直接提取微生物的全部DNA，构建关于宏基因组的文库，利用基因组学的研究方式研究环境样品中包含的全部微生物的群落功能及其遗传组成。宏基因组测序是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种开发新的生理活性物质（或获得新基因）、研究微生物多样性的新方法和新理念。②16S rRNA高通量测序技术。高通量测序技术（next generation sequencing）（NGS）与传统测序相比，可以一次对几十万到几百万条核酸分子进行同时的序列测定，从而对一个物种的特定基因组进行全面而细致的分析，所以又称为深度测序（Deepsequencing）[6]。③通过16S rRNA基因克隆、测序分析研究瘤胃微生物多样性。随着PCR技术和基因克隆技术的迅速发展，使核糖体 RNA基因序列分析成为可能，同时使对复杂的微生物系统的研究得到了促进。目前，这种从序列分析、16S rRNA基因的克隆到系统发育分析的技术为研究环境微生态提供了一条有效的途径[7]。④利用DGGE和 TGGE技术来研究瘤胃微生物区系组成结构。近年来，随着DNA 指纹技术 (fingerprinting techniques)的迅速发展，微生态研究者开始关注温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis，TGGE)和变性梯度凝胶电泳 (denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技术，这两种技术为研究菌群动态变化及其结构提供了有效的手段。1993年， Muyzer等人首次利用 DGGE研究了环境中微生物区系的变化[8]。DGGE和 TGGE技术可以将长度相同，但序列不同的 DNA片段分开。该技术已经广泛地用来研究复杂的环境微生态系统、分离细菌、监测其区系组成变化、检测 PCR和克隆过程中产生的偏差以及比较各种 DNA抽提方法的效率等。
在上述研究中，基于16S rRNA基因高通量测序技术研究反刍动物瘤胃微生物菌群结构应用较多。高雨飞等[9]应用16S rRNA基因高通量测序技术研究了锦江牛瘤胃细菌多样性，发现了相对其他大品种牛而言，锦江牛瘤胃细菌多样性较低；锦江牛瘤胃中最优势菌门为拟杆菌门，其次是厚壁菌门；普雷沃氏菌属是锦江牛瘤胃中最优势细菌属。毛胜勇等[10]通过研究高精料对奶牛瘤胃微生物区系的影响，发现在高精料日粮饲喂下，奶牛瘤胃细菌菌群结构发生改变，革兰氏阴性菌(如拟杆菌门细菌）的相对丰度降低，导致瘤胃内异常代谢产物内毒素的累积，可能对动物健康造成危害。
随着研究者将研究对象扩大到小品种反刍动物瘤胃微生物及不断优化的研究方法，不仅使瘤胃微生物多样性数据库大大丰富了，而且表明瘤胃微生物群落组成受到生长发育阶段、健康状态和宿主遗传背景的影响，并且随季节、日粮等环境条件的变化而呈现出动态的变化[11]。在瘤胃微生物的功能方面，主要围绕瘤胃从宏基因组学和微生物基因组学的角度进行分析。在多样性方面，群落生态学可通过OTU和α-多样性分析来反映微生物群落的丰度和多样性[12]。α-多样性的测度又可分成四类①物种相对多度模型②物种丰富度指数③物种丰富度与相对多度综合形成的指数, 即物种多样性指数或生态多样性指数④物种均匀度指数。由于瘤胃微生物种类繁多，数量巨大，尽管有关瘤胃微生物功能和多样性的研究已经积累了大量的研究数据，但瘤胃微生物群落中影响生产性能和宿主代谢的关键功能细菌的分离、鉴定、作用模式及其利用等问题仍然悬而未决。
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