鲫鱼皮肤维隆气单胞菌的分离鉴定与致病性评价(3)
1.3 实验方法
1.3.1 细菌分离纯化
在无菌操作环境下，对患病鲫鱼进行解剖，将出血的皮肤用剪刀从鱼身上剪取下来，从病变的皮肤刮取细菌，采用四区划线法在TSA平板中29 ℃培养18～24 h；挑取单个菌落接种另外的TSA平板上，29℃培养18～24h，经过3-4次传代纯化后，将得到的单菌落暂时命名为KP。12h摇菌后将菌液放在-80℃冰箱中保存备用。
1.3.2 菌落形态观察、生理生化特性
无菌条件下，挑取少许的KP菌体于载玻片上的水滴混合涂成薄膜，室温干燥后在酒精灯上微火固定3次；待冷却后滴加草酸铵结晶紫染色液，初染3 min；冲洗干净，然后滴加碘液媒染2 min；再滴加95％乙醇脱色，30 s后倾去乙醇并冲洗干净，最后滴加番红染液，复染3 min，水洗干净，晾干后镜检并拍照。
观察4代平板细菌的生长状况，并进行生理生化反应实验。用接种环挑取第4代菌株，然后将挑取的菌株接种于28种细菌生理生化鉴定管中，重复上述步骤将剩余生化管完成，放于29℃恒温培养箱中培养，24h后观察结果。
1.3.3 药敏实验
在酒精灯下用无菌棉签蘸上菌液均匀的涂在TSA培养基上，无菌镊子取出药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司）于培养基表面标记的点上并轻轻按压，重复上述步骤完成29种药敏纸片，分别盖上皿盖，倒置平板于29 ℃恒温箱中培养18~24 h，测量抑菌圈直径并作好记录。
1.3.4 人工感染试验
选取市场上健康的鲫鱼用于感染试验。（鱼大约长15cm，重60g±5g），分为两组，对照组与试验组各8条鲫鱼，吸取分离得到的纯培养菌株作为供试菌做致病性试验，将分离菌接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）培养基中29℃培养12h后，用移液枪吸取6 ml菌液于干净离心管中，用高速离心机3000 rpm离心10 min后，除去上清保留沉淀，加0.8 ml无菌生理盐水并混匀。用无菌的注射器吸取0.2ml/条细菌稀释液注射实验组鲫鱼的腹腔内，用生理盐水注射对照组鲫鱼腹腔，分别放于13℃±2℃水温饲养，每24h观察一次鲫鱼的生存情况并记录，共观察72h。