5个转灰飞虱CYP基因果蝇品系的建立和定量PCR验证(3)
1 材料与方法
1．1 供试果蝇品系及饲养方法
1．1．1 供试果蝇品系
果蝇W1118品系：白眼，灰体直翅。
果蝇35568品系：白眼，背部长刚毛，attP位点位于其三号染色体上，可与载体pUAST-attB特异性识别并发生重组交换，使外源基因整合到果蝇的基因组中。
果蝇Sb/TM6B品系：白眼，短体，背部短刚毛、簇刚毛。
果蝇BL8641-GAL4品系：红眼，长刚毛，含有启动目的基因全身表达的强启动子β-tubulin。
由东南大学发育与疾病相关基因教育部重点实验室提供以上果蝇品系。
1．1．2 果蝇的饲养
果蝇用由玉米粉、酵母粉、白糖和琼脂做成的人工饲料（配方见表1-1）饲养。实验室饲养条件为：光周期为14L：10D，温度为（25±2）℃，相对湿度为60%~70%。
表1果蝇饲料配方
成分名称 含量（/800ml）
玉米粉(cornmeal) 68 g
酵母粉(yeast) 18g
白糖(sugar) 52 g
琼脂(agar) 6g
尼泊金甲酯(methylparaben) 0.52g
1．2 主要试剂与仪器
1．2．1 实验主要试剂
本实验主要使用的分子试剂分别为宝生物工程（大连）有限公司（TakaRa）生产的M-MLV反转录酶和荧光定量PCR试剂盒SYBR® Premix Ex Taq (Prefect Real Time)
，Invitrogen公司生产的TRIzol® Reagent试剂，美国Axygen公司生产的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，南京金斯瑞公司生产的PCR引物合成和序列测序试剂，南京生兴生物技术有限公司生产的常规生化试剂。
1．2．1 实验仪器设备
本实验主要使用的仪器有：宁波江南仪器厂生产的光照培养箱，美国Thermo Fisher公司Sorvall Legend Micro 21R离心机，美国MJ Research公司PTC-200热循环仪，北京优尔一仪器厂小型水平电泳仪，美国Bio-Rad公司凝胶成像系统Gel Doc2000，美国Applied Biosystems公司实时定量PCR 仪ABI Prism 7500 Sequence Detection System，日本SANYO 公司制冰机SIM-F124，美国MMM公司烘箱MC000712，德国Eppendorf公司微量移液器，德国Eppendorf公司毛细枪头，美国WPI公司显微注射系统（PV820），德国徕卡（Leica）仪器有限公司Leica显微镜。
1.3显微注射
1.3.1制作产卵碟
称取4.8 g琼脂和3.0 g蔗糖，加入120 ml蒸馏水至烧杯中溶解煮沸，充分摇匀至无气泡，放置室温待稍微冷却后，向烧杯中倒入120 ml葡萄汁，将两者混匀后配置成240ml葡萄汁培养基，倒入培养皿中。冷却后，放入4℃冰箱保存待用。
1.3.2 新鲜胚胎的收集
（1）取羽化后3~4天的成蝇若干，置于黑暗环境中刺激3 h，为使果蝇产卵速度加快。
（2）将全部果蝇放入广口塑料瓶中，瓶底座紧密与涂少许熟酵母的葡萄汁产卵碟对接 后，用封口膜缠绕两至三圈密封，重新放置于25℃黑暗环境。
（3）每隔20min更换一次产卵碟，收集此时间段内新鲜胚胎，以消除陈旧胚胎的污染 带来的实验干扰。
（4）在已收集新鲜胚胎的产卵碟中倒取适量50%的次氯酸钠溶液，将胚胎浸没在该溶 液中计时60s（用刷子轻轻将胚胎从产卵碟表面脱离，使其混合于次氯酸钠溶液 中，以去掉最外面的一层绒毛膜）。
（5）用超纯水充分淋洗胚胎表面残留的次氯酸钠溶液1~2min，以避免次氯酸钠溶液 对胚胎发育造成不良影响。
（6）用吸水纸将超滤膜上的水吸干，然后用毛笔将胚胎轻轻扫于绿色琼脂块上，选取 白色、不透亮，内容物分布均一的胚胎。
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