6)加入500μl异丙醇,以沉淀RNA,缓慢上下轻柔颠倒几次混匀,然后置于冰上10     min;
7)4℃,12,000g离心10min,迅速弃掉上清液;
8)加入1ml的75%乙醇溶液,涡旋片刻,使之与壁分离,然后于4℃,7500g离心5     min,用移液枪小心去除上清液;
9)可重复步骤7一次;
10)空气或真空干燥5~10min,加40μl无RNase的水(RNase-free water),用枪头       吸打均匀。-70℃贮存备用。
11)RNA质量及浓度检测:用0.1%的DEPC水配制0.5×TBE电泳缓冲液,0.8%的琼脂   糖凝胶电泳检测RNA的质量;紫外分光光度计对RNA进行浓度和质量检测,OD     值在1.6~1.8之间为理想值。
(2)cDNA第一链合成:依据TAKARA TM 反转录试剂盒说明进行cDNA第一链的合      成,操作如下:
1)首先在无菌的PCR管中依次加入:
Total RNA    2.0μl   
5×gDNA Eraser Buffer     2.0μl   
gDMA Eraser                                                                                                         1.0μl   
RNase Free dH2O    up to 10 μl   
Final volume    10 μl   
2)将上述混合物放置于于PCR仪42℃2min 4℃保存;
3)然后在第2步PCR管中加入下列反转录反应液(20 μl):
5×PrimeScript Buffer 2(for real time)          4.0 μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I
      1.0 μl
RT Primer Mix                                             1.0 μl
步骤1的反应液         10.0 μl
RNase Free dH2O      up to 20 μl
Final volume          20 μl
4)将上述混合物于PCR仪中完成逆转录过程:37℃保温15 min,85℃保温5sec,4℃    保存。合成的cDNA置于-20℃贮存备用。
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