5个转灰飞虱CYP基因果蝇品系的建立和定量PCR验证(4)
（7）用尖头镊子轻轻移动胚胎的腹部或侧部，使胚胎按照固定的方向呈线性整齐排列。 排列时，胚胎的后端向外，前端向内（如图1-2）。
（8）在盖玻片的一端边缘贴一块大约1 cm宽的双面胶，将排好的胚胎粘在盖玻片上的 双面胶上，胚胎尾部全部朝外。
（9）将排列好的胚胎玻片放入干燥剂中干燥4~5 min，干燥的时间可因环境的温度和 空气湿度进行调整，以注射时胚胎内溶物不易溢出为佳。若卵黄膜被注射针尖推 凹，不能立即返回到起始状态，需缩短干燥时间；若针尖很顺利的刺入胚胎，但 是细胞质在针尖进入后立即流出，表明胚胎内压过大，需要适当延长干燥时间。
（10）经干燥好的胚胎，用胶头滴管吸取适量卤烃油（Halocarbon Oil 700，sigma）覆 盖在已干燥的胚胎表面，即可用于注射（如图1-2所示）。
果蝇胚胎排列示意图
1.3.3显微注射
（1）用毛细枪头从显微注射玻璃针扎入胚胎尾部一端，完成显微注射。
（2）注射完毕后，将胚胎表面的矿物油刮去少许，然后放入湿度较高的培养皿中，将 培养皿置于18℃恒温培养箱中培养。
（3）经过约36 h培养后，观察胚胎的发育情况，将即将孵化或已孵化的幼虫轻轻挑到 柔软湿润的饲料表面，置于25℃培养箱中正常培养。
（4）约2周后，将羽化的果蝇，分别与W1118进行杂交，挑取后代中红眼果蝇，即为转 基因果蝇。
1.4转基因果蝇品系的纯化
1.4.1与W1118果蝇杂交
（1）已进行过注射果蝇为F0代，F0代成虫与W1118果蝇以1：2进行单杂交；
（2）与W1118果蝇单杂交的后代为F1代，从F1代中挑取红眼的个体，与W1118果蝇进行单杂交。
（3）F1×W1118的后代为F2，将F1代果蝇去除掉，挑取F2代中红眼灰体果蝇保存待用。
1.4.2与平衡子杂交
F2代红眼灰体果蝇与平衡子Sb/Tm6B果蝇品系以♂1：♀2的比例进行杂交，选择杂交后代中性状为红眼、短体、簇刚毛的处女蝇与红眼、短体、簇刚毛雄性果蝇自交。将F3代中短体的蛹去除，挑选红眼、长体处女蝇与红眼、长体雄蝇杂交，繁殖后代即为转基因纯合品系，可放入18℃培养箱中保种。
1.4.3与GAL4品系杂交
取转基因纯合果蝇品系与GAL4品系按♀2:♂1进行配对，所产生的后代即为启动目标基因超量表达的果蝇品系。每管中，转基因纯合品系雄果蝇20只与GAL4处女果蝇40只杂交，待后代羽化为成虫后第4天，将雌性果蝇收集待用。
1.5转基因果蝇品系的分子验证
1.5.1总RNA提取及cDNA第一链合成
（1）TRIzol法提取果蝇的总RNA：分别取羽化后3至4 天的果蝇雌成虫10~15只左右， 设3个生物学重复。按照Trizol试剂说明进行总RNA提取。提取步骤如下：
1）准备工作：将4℃离心机预冷，并查看程序；打开超净台紫外线灭菌20min，开始吹 风后，戴手套，并用酒精棉球擦拭，拧松所有试剂瓶盖；
2）取10~15只果蝇成虫迅速倒入匀浆器中，用纸杯捏出小嘴后，倒入多半杯液氮，充 分用力研磨均匀，再加入1ml Trizol试剂充分匀浆，进行抽提，并将匀浆棒置于废 缸。研磨完成后转入1.5ml离心管中，置于冰上暂时保存；
3）4℃，12,000g离心15min后，将上清液移取至另一个新的1.5 ml离心管中；
4）加入200μl氯仿，盖紧离心管盖，剧烈震荡15s，静置计时10min；
5）4℃，12,000g离心20min，此时管内液体分为三层，小心地用枪头将上层水相转 移到新的1.5 ml离心管中；
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