大豆GmWRKY39基因功能研究及RNAi载体的构建
毕业论文关键词： 大豆；大豆疫霉； GmWRKY39； RNAi；植物激素；抗病反应
Functional analysis and RNAi vector construction ofGmWRKY39 in soybean
Abstract： Phytophthora root and stem rot, caused by Phytophthora sojae, is a disease who isharmful to soybean in its growth and development and causing significant yield losses. Researchesshowed that GmWRKY33 is able to participate in the plant immune system and is an essential partof the pathogen responses of plants. Here we obtained the WRKY33 homologous gene GmWRKY39in soybean and performed preliminary study on its functional participation in soybean-Phytophthorasojae interaction. From the treatment by Phytophthora sojae and plant hormones, we found thatGmWRKY39 genes in soybean can response to Phytophthora sojae infection as well as planthormone treatment. Moreover, we constructed the RNAi vector and transformed it intoAgrobacterium rhizogenes K599, which provided a foundation for the further functional analysis ofthis gene.
Key words： Glycine max; Phytophthora sojae; GmWRKY39; RNAi; Plant hormone; Diseaseresistance
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言1
1材料与方法3
1.1实验材料3
1.2基因克隆及组织表达分析3
1.3大豆疫霉处理方法4
1.4植物激素处理方法4
1.5RNA提取和荧光定量4
1.5.1RNA提取4
1.5.2RNA的反转录，cDNA第一链的合成.4
1.5.3荧光定量5
1.6RNAi载体的构建.5
1.7大肠杆菌热激转化5
1.8质粒提取5
1.9农杆菌K599感受态制备.5
1.10农杆菌电击转化5
2结果与分析6
2.1大豆中WRKY39基因的组织表达分析.6
2.2大豆疫霉诱导条件下大豆WRKY39基因的表达分析.6
2.3植物激素处理条件下大豆WRKY39基因的表达情况.7
2.4大豆WRKY39RNAi载体的构建.8
3讨论9
致谢9
参考文献9
引言大豆的种子富含油分和蛋白质，因此大豆是食物，饲料和工业原料的重要来源之一，然而很多的病原物能够侵染大豆从而导致其大幅度减产。在自然界中，能够侵染大豆并造成其产量损失的病原物主要有 5 大类，分别是病毒，细菌，卵菌，真菌和线虫(Whitham et al. 2016)。
大豆疫霉根腐病，由大豆疫霉引起的大豆中最具毁灭性的卵菌病害，是世界范围内大豆生产的毁灭病害之一。大豆疫霉菌属于茸鞭生物界卵菌门霜霉亚纲腐霉目腐霉科疫霉属(Tyler 2007)，它能够在几乎所有大豆的主要产区对其各个生长发育时期侵染它的所有组织和器官。植物由于其只能固着在某一地点，因此不具备类似于动物的特异性免疫细胞。但是植物却有着先天获得的强大而精密的免疫体系。为了抵抗试图侵染植物的病原体，植物会激活一系列防御机制。根据前人研究，免疫体系中的两大分支现已明确。第一种是病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern， PAMP)激发的抗性(PAMP-triggered immunity， PTI)，通过识别病原物特异分子而产生并激活下游促细胞分裂素蛋白 (mitogen-activated protein， MAP)激酶级联反应和防卫基因。第二种是效应物激发的抗性(effector-triggered immunity， ETI)，对无致病性的病原体的识别将会引发水杨酸（ SA）、 茉莉酸（ JA）等植物激素信号转导途径和激发系统获得性抗性(systemic acquired resistance， SAR) (Naoumkina etal. 2008)。在高等真核生物中，转录调控是一个需要包括转录因子在内的多种组分共同参与的精密而复杂的过程。而此调控对植物的生长、发育、植物防御以及应对生物和非生物胁迫等多个生物过程都有着十分重要的作用。在参与调控的各种组分中，转录因子尤为重要。 被称为反式作用因子的转录因子(transcription factor， TF)，是一类能与某些基因上游特异核苷酸序列结合后，识别和结合在基因启动子区的顺式作用原件(cis-acting element)、对转录具有激活或抑制作用的 DNA 结合蛋白。自 1987 年第一个转录因子基因克隆以来，已有数百种编码转录因子的基因在高等植物中被发现。 从现已得到的拟南芥基因组的测序结果来看，预计有 3018 个编码转录因子或与转录相关的基因，约占估计基因总数的 16.9%。拟南芥中的转录因子在基因组中所占的高比重表明了转录调控的复杂性与对转录因子研究的必要性。植物在其整个生命周期中会持续受到包括植物病害在内的不同环境胁迫的影响。这些胁迫可以同时影响植物的生长发育或改变植物种类的分布。为了适应这些挑战，植物进化出复杂的机制来接受体内的信号，并以恰当的生理或形态学变化来响应各种胁迫(Tuteja 2007)。在这些机制当中，一系列的与胁迫相关的基因通过直接作用或诱导下游目标基因的上调或下调来保护植物 (Skriver andMundy 1990)。 转录因子作为主要的调节因子，在植物的生长发育和响应内部以及环境信号的过程中起着作用。植物中的转录因子与后生动物不同，其中后生动物的转录因子大多数都属于 bHLH 家族，同源域蛋白和 C2H2 锌指蛋白。然而在植物中主要的转录因子家族除了 bHLH家族，同源域蛋白和 C2H2锌指蛋白之外，还有 AP2/ERF， bZIP， MADS box， MYB， NAC 以及 WRKY 家族蛋白（ Weirauchand Hughes 2011）。近年来，对于转录因子家族的遗传研究表明，面对植物病原物侵染时大量的转录因子家族都会参与植物的响应从而参与植物防卫反应的调节。