草莓MYB基因EOBII的克隆与功能研究
毕业论文关键词：草莓；EOBII；MYB 转录因子；
Molecular Cloning and Functional Analysis of Strawberry MYB Gene EMISSION OF BENZENOIDS II
Abstract：MYB transcription factor is one of the most abundant transcription factors in plants, which plays important roles in plant morphogenesis, stress response and secondary metabolites regulation. Studies have shown that strawberry MYB transcription factor EMISSION OF BENZENOIDS II (EOBII) can regulates the biosynthesis of aromatic compounds in fruits, but the molecular mechanism is not clear. In this study, the EOBII gene was amplified from the ripe fruit of woodland strawberry, which is identical with the EOBII gene in cultivated strawberry. In order to analyze the function of EOBII, both prokaryotic and eukaryotic expression vectors of EOBII were constructed and the fusion protein with GST tag was expressed and purified from Escherichia coli, furthermore, genetic transformation was performed to generate transgenic plants with EOBII overexpression and gene silencing, which allows us studying the function of this gene in biochemical and genetic approaches.
Key words: Strawberry；EOBII；MYB Transcription factors；
目录
摘要：２
关键词：２
Abstract：.２
Keywords:２
前言：２
1材料与方法４
1.1材料与试剂.４
1.1.1森林草莓Hawaii-4不同组织中RNA的提取４
1.1.2FvEOBII基因的扩增与克隆载体的构建.４
1.1.3FvEOBII的原核与真核表达载体构建.４
1.1.4GST-EOBII的原核表达与纯化.５
1.1.5FvEOBII的遗传转化.５
1.2实验方法.５
1.2.1森林草莓Hawaii-4不同组织中RNA的提取５
1.2.2FvEOBII基因的扩增与克隆载体的构建.６
1.2.3FvEOBII的原核与真核表达载体构建.７
1.2.4GST-EOBII的原核表达与纯化.８
1.2.5FvEOBII的遗传转化.９
2结果９
2.1森林草莓各组织中总RNA的提取与EOBII基因扩增.９
2.2森林草莓EOBII的蛋白序列分析.９
2.3FvEOBII的表达载体构建.１０
2.4GST-EOBII融合蛋白的原核表达与纯化.１１
2.5FvEOBII的遗传转化.１１
3讨论１２
致谢１２
参考文献：１３
前言： MYB转录因子是植物中最大的一类转录因子，因含有保守的DNA结合结构域，即MYB结构域而命名。该结构域通常包括1-4个氨基酸序列重复(R基序),因此，根据R基序的个数可将MYB转录因子分为四类：第一类是1R-MYB/MYB-related，含有单个或不完整R基序；第二类是R2R3-MYB，含有两个R基序， 它们是植物MYB转录因子中数量最多的一类，也是功能分化最多的一类；第三类是3R-MYB, 含有3个R基序；第四类是4R-MYB，含有4个R基序，它们是植物MYB转录因子中数量最少的一类(Dubos et.al,2010)[1]。 MYB转录因子在植物中的功能多样，参与了包括器官和组织的生长发育、环境应答以及次生代谢产物的合成调控等多个生物学过程。研究发现，拟南芥的MYB23不仅与MYB5共同调控表皮毛的伸长和分枝(Li et al. 2009) , 还与MYB66/WER调控根毛的分布(Kang et al. 2009)[3]。同样在棉花中的研究也表明，棉花的MYB转录因子GhMYB25和GhMYB25-like均参与表皮毛的发育与分化，在棉纤文的早期发育中起重要作用(Machado et al. 2009)[4]。在植物的生长过程中，经常会受到各种外界环境因素的胁迫，目前已经发现多个MYB转录因子参与植物对生物和非生物胁迫的响应。在受到病原菌侵染时，拟南芥AtMYB30通过诱导超长链脂肪酸的合成而激活植物的超敏反应，从而提高植株的抗病能力(Raffaele et al. 2008)[5]。在干旱和高盐等胁迫下，拟南芥通过调控脱落酸的含量诱导AtMYB2的表达而提高其耐逆性(Abe et al. 2003)[6]。另外，菊花中MYB2基因也具有相似的功能，过量表达这些基因的转基因植株的耐盐、抗旱能力显著提高(Shan et al. 2012)[7]。除了以上调控植物生理功能外，在拟南芥、玉米、金鱼草和矮牵牛等模式植物以及多种园艺植物中的研究发现MYB转录因子作为调节蛋白还参与苯丙烷类次生代谢途径的调控。 研究发现，番茄MYB转录因子SlMYB12是黄酮醇生物合成途径的主要激活子，目前发现的粉红色番茄品种都与SlMYB12基因有关，有的是由于SlMYB12表达量下降而导致的，而有的则是SlMYB12基因功能缺失导致的(Fernandez-Moreno et al. 2016)[8]。葡萄果皮中花青素合成则受VvMYBA1-1、VvMYBA1-2和VvMYBA2这三个基因的调控(Kobayashi et al. 2004;)[9]。Butelli等人报道，血橙中花青素的大量积累是由于MYB转录因子Ruby受附近处插入的一个类Copia逆转座子诱导而导致的(Butelli et al. 2012)[10]。而在苹果中，Takos等人发现，苹果果皮中花青素的含量受MdMYB1和MdMYBA两个基因的调控，其转录丰度与果皮中花青苷的积累正相关(Takos et al. 2006; Ban et al. 2007) [11] [12]。苹果果肉中花青素的含量则受MdMYB10调控，过量表达MdMYB10可以显著增加转基因苹果幼苗中的花青素含量(Espley et al. 2007)[13]。另外，MdMYB10的同源基因也在草莓、杨梅、梨、油桃和甜樱桃等其它园艺作物中被鉴定和分离，这些MYB转录因子的功能与苹果的MdMYB10相似，均可显著影响果实花青素的积累（刘晓芬等，2013）[14]。