木霉漆酶基因的原核表达研究(2)
本文就真菌木霉漆酶基因的原核表达进行研究，可为环境污水处理提供新的功能基因和理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料与试剂
1.1.1 实验材料
木霉漆酶基因（Laccase）已构建到原核表达载体PET52b上，获得了重组质粒PET52b-Laccase，且此重组质粒转入了大肠杆菌DH5α。
1.1.2 实验试剂
LB培养液，Amp，LB固体培养基（加Amp），24mg/mLIPTG诱导剂，30% Acr-Bia储备液，1.5mol/L Tris-HCl分离胶缓冲液（pH8.8），1.0mol/L Tris-HCl浓缩胶缓冲液（pH6.8），蛋白电泳缓冲液（pH8.3），10%SDS溶液，10%过硫酸铵溶液，5×上样缓冲液，考马斯亮蓝R-250染色液，脱色液，蛋白Mark，1.0mmol/L愈创木酚，50mmol/L琥珀酸钠（pH4.5），CuSO4，MnSO4，FeSO4，溴酚蓝，孔雀石绿，甲基蓝，PBS缓冲液（pH4.5）。
1.2 实验仪器
超净工作台，移液枪，锥形瓶，烧杯，恒温加热磁力搅拌器，量筒，玻璃棒， 容量瓶，pH计，高压蒸汽灭菌锅，摇床，高速离心机，电子天平，蛋白垂直电泳仪，电磁炉，水平摇床，可见光分光光度计，电热恒温水浴锅，冰箱等。
1.3 实验方法
1.3.1 实验思路
针对木霉漆酶基因的原核表达研究，首先活化菌种，然后利用IPTG诱导漆酶基因原核表达，分时间梯度对表达产物取样后进行SDS-PAGE[6]蛋白电泳检测，以此来确定木霉漆酶基因是否原核表达，并对不同诱导时间的表达产物以愈创木酚为底物，采用可见光分光光度计法[7]在波长465nm[8]测定OD值的变化，从而确定木霉漆酶活性，然后探究温度以及金属离子对酶活的影响，并对其脱色功能进行验证，最后分析图表得出结论。
1.3.2 药品的配制
配制药品时，根据不同药品物理性质（如溶解性，沸点，挥发性等）以及是否需要无菌操作配制等严格配制药品，定容要精准，且要注意药品使用时效，是否需要现配现用等条件，还要注意保护自身安全，带手套口罩操作。
（1） LB培养基
准确称取蛋白胨1.0g，酵母浸粉0.5g，氯化钠1.0g（配置LB固体培养基时还需加1g琼脂），加水溶解定容至100ml，用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性，灭菌（LB固体灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时无菌操作下倒平板。
（2）10%SDS溶液
准确称取SDS 10g，用灭菌水溶解，定容至100mL，室温保存（SDS，白色粉末，易吸入，带口罩称取药品以防吸入鼻腔）。
（3） 5×蛋白电泳上样缓冲液
1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8) 1.25mL
SDS 0.5g
溴酚蓝（BPB) 25mg
甘油(灭过菌的） 2.5mL
灭菌水定容至5mL,分装小EP管，每管500ul，-20℃保存。注意，使用前每管（每500ul加25ul的β-巯基乙醇。
（4） 5×蛋白电泳缓冲液
Tris碱 7.55g
谷氨酸（Gly） 47g
SDS 2.5g
用蒸馏水溶解，定容至500mL，室温保存。注意，使用前需要稀释为1×蛋白电泳缓冲液，并调pH至8.3。
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