鱼类性别分化关键基因的鉴定与系统进化分析(2)
阅读文献可知，在鱼类的性别决定类型里，几乎囊括了所有动物性别决定的类型。鱼类的性染色体决定类型与上段所述的动物决定类型相同。性别分化的方向有时也受环境的影响[4]。另外关于性别决定基因这种方式，鱼类里有很多种，包括性别连锁基因，重复序列，SRY基因，锌指结构基因，芳香化酶基因，H-Y抗原，Sox基因家族，DMY基因，DMRT基因等。本文就是以性别决定基因为立足点，对选定的基因进行分析研究[5]。
我们选定有15个物种代表，其中包括现阶段研究最多的人类(Homo sapiens)，以及鱼类和部分哺乳动物和鸟类。选定的代表基因有四种，分别是DMRT1，DMRT2，DMRT3和SOX9。本研究利用生物信息学手段详细剖析了鱼类性别分化关键基因的序列和进化特征，并分析了关键氨基酸位点在蛋白三文结构中的位置[6]。本课题对深入认识鱼类性别分化关键基因的结构和功能提高理论依据，同时为探索这些位点对蛋白三文结构的稳定性贡献率提供指导[7]。
在性别分化关键基因的研究进程中，人类和小鼠中迄今为止发现的SOX9基因已达24个。据统计，目前已在各种不同物种包括哺乳类、鸟类、爬行类、鱼类及昆虫中克隆了不少于100个这样的基因[8]。SOX 基因家族在HMG- box区其氨基酸序列从人类到果蝇都是高度保守的, 强烈的进化保守性说明SOX 家族的基因在许多物种的睾丸和其它组织分化和发育过程中起着重要作用。该家族中有一个与性别决定直接相关的基因，被命名为SOX9。与其他SOX 基因不同的是SOX9 具有两个内含子, 其中一个位于HMG- box 区[9]。SOX9在胚脑、肝、肾中表达。在发育中的长骨组织切片中发现SOX9 在软骨膜及软骨细胞中高水平表达[9]。
另外一个选定的是DMRT基因，目前在鱼类中，已经报道的有五种，分别是DMRT1、DMRT2、DMRT3、DMRT4和DMRT5[10]。本文选定前三种进行研究。查阅文献后可知，有一个保守基序DM结构域都存在于该类基因编码的蛋白质中，通过锌指方式与特定的DNA序列相结合，并由此控制着性别的分化和生殖腺的发育。
本研究基于最新版本的性别决定基因家族，以鱼类性别分化关键基因为研究对象，从Ensembl数据库中下载鱼类性别分化基因的核酸和蛋白序列，利用生物信息学手段分析这些基因的结构特征、保守基序、功能结构域、选择压力以及系统进化关系。
1 数据与方法
1.1基因选择与物种抽样
在老师指导下查阅大量文献后，该研究选定以下15个物种，包括研究最多的人类，以及余下的14种(见附录表1)。选定的基因有4种，分别是DMRT1，DMRT2,DMRT3和SOX9。
1.2基因序列检索与下载
本文数据采用从ensembl数据库(http://asia.ensembl.org/index.)下载的方式，下载时要找氨基酸序列长度大概一致的基因。下载数据后通过CLUSTALX软件进行筛选过滤，得到目标基因。
1.3基因的序列比对与聚类分析
针对目标基因序列的比对和聚类分析，本文利用生物信息学Clustalx软件和MEGA6.0软件对选定的物种所对应的基因的氨基酸序列进行序列对比，并做出进化树图，然后对其进行数据分析。
1.4 蛋白保守基序与功能结构域分析
为了鉴定鱼类性别决定关键基因编码蛋白的保守基序，MEME软件被用于蛋白保守基序的分析，利用该软件做出蛋白保守基序图，进行应有的数据分析。为探明该类基因编码的蛋白质的保守基序和功能结构域之间的关系，Pfam用来预测这些蛋白的典型功能结构域。
1.5蛋白正选择位点的检测
鱼类性别分化关键基因编码的蛋白多序列分析由Clustal X软件执行，在参数默认条件下，其进化树构建由MEGA6.0完成。针对每类蛋白，利用Pal2nal工具准备密码子比对序列。为阐明鱼类性别决定关键基因受到的选择压力，利用位点特异模型分别对每类蛋白内的性别决定基因进行选择压力检测，基于贝叶斯算法鉴定出正选择氨基酸位点，推算出相应概率值，该计算过程由PAML3.15软件完成[11]。