苦蘵查尔酮异构酶超表达载体的构建及功能研究(2)
2、 基因克隆
基因克隆技术主要是指通过体外重组，将目的基因片段（DNA序列）插入特定载体，然后转入受体细胞，使目的基因扩增并最终表达成蛋白质，从而对目的基因的生物学特性等进行进一步研究。它诞生于二十世纪70年代初期，并且在之后得到了迅猛的发展，为了满足不同研究需求，各种克隆方法应运而生，并且每一种基因克隆方法都在不断地发展和完善。研究者们可以通过基因克隆技术获得某些具有特殊功能的目的基因序列，然后再结合其他分子生物学技术对目的基因的功能及特性进行进一步的研究[5]。
基因克隆技术的特点是在分子水平上的操作和在细胞水平上的表达，主要步骤包括分、切、连、转、选等五步：（1）分也称作目的基因的获取，是指分离制备合格待操作的DNA，基因克隆方法的分类主要就是根据获取方式的不同来分类的。（2）切是指用特异的限制性内切酶切开适用的载体，目的基因获取后，要转入受体细胞中必需要借助如细菌质粒等能够携带外源基因的载体，它们具有自主复制和转录能力，以确保能够在受体细胞中表达其所携带的遗传信息。（3）连就是将目的基因与载体用DNA连接酶连接起来，形成重组的质粒。包括平末端连接与粘性末端连接两种，连接是获得重组质粒的前提和条件，只有使目的基因与载体成功连接，才能在重组质粒导入受体细胞后使目的基因成功的翻译并表达。（4）转是用特定方法将重组质粒导入受体细胞，导入真核受体细胞的过程叫叫转染(transfection)，导入原核细胞的过程称为转化(transformation)，而由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程则称为转导(transduction)。（5）选即对获得的重组子进行筛选，从受体中挑选出携带正确重组质粒的个体 ，主要方法有蓝白斑筛选法、限制酶酶切法、免疫筛选法以及PCR筛选等。目前，常用的基因克隆方法有：功能克隆、图位克隆、基因芯片、文库法、表达序列标签等。
3、 苦蘵查尔酮异构酶
类黄酮（flavonoids）化合物是一种次生代谢产物，具有较强的生物活性，广泛存在于植物的叶、花以及果中，是一组天然色素前体物，因为其多呈黄色被称为生物类黄酮。生物类黄酮具有抗氧化、抑制脂质过氧化反应、预防心血管疾病、防癌等的作用。类黄酮在植物体内生物学意义相当重要，与生长素的运输、根系发育及向地性、种子萌发、植物与共生微生物的信号互作功能相关，而且还具有紫外线保护、抵御外来生物等作用，是植物在长期的生态适应过程中源`自,优尔`文.论"文'网[www.youerw.com为抵御恶劣生态条件等攻击而形成的一大类低分子量的多酚类次生代谢产物。在黄酮类化合物中具药用价值的化合物非常多，还有许多被证明具有抗癌活性。
根据类黄酮化合物结构的差异主要被分为6类，包括：查尔酮（chalcones）、黄酮（flavones）、黄酮醇（flavonols）、黄烷双醇（flavandiods）、花青素原（proanthocyanidins）、花色素苷（anthocyanins）。大量研究表明，查尔酮合成酶（CHS）及异构酶（CHI）是类黄酮合成途径中的两个关键酶，与植物育性、抗逆性密切相关（Taylor and Jorgensen，1992； van der Meer et al.， 1992；Yu et al.， 2005）[3]。