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亚精胺对淹水胁迫下玉米幼苗根系抗氧化代谢调控(3)
FW: 样品鲜重(g);
0.1:OD240 每下降 0.1 为 1 个酶活力单位(U) ;
T:加过氧化氢到最后一次读数的时间(min)。
1.4超氧化物岐化酶(SOD)活性的测定
按刘萍、李明军的比色法测定SOD活性[9]。具体方法:
1.4.1酶液的制备:
称取玉米根部0.5g剪碎,置于研钵(预冷)中,加入5mL预冷的 50mmol/L(pH7.8)磷酸缓冲溶液(分多次加入),在冰浴下研磨成匀浆后,置于3000r/min离心10min(2~4℃)。上清液即为酶的粗提取液,测量其总体积并记录。
1.4.2酶活力的测定:
取3支试管,编号,依次按表2加入试剂。用黑纸包上2号管,比色时作空白,与其他两管一起放在荧光灯(光强60umol/m2 •s)下,照光10min,然后把试管均罩上黑布,测定待测样品和无酶反应液在560nm处的吸光度值。
表2 各溶液加入量
试剂 试管1 试管2 试管3
反应介质/ml 3.9 3.9 3.9
酶提取液/ ml 0.1 0.1 0
磷酸缓冲液/ ml 0 0 0.1
备注 待测样品 空白 无酶反应液(对照)
1.4.3计算SOD的活力:
SOD总活力=(A0-As)×VT/(A0×0.5FW×V1)
式中SOD总活力以每克鲜重酶单位表示;
A0为照光对照管的吸光度值;
AS为样品管的吸光度值;
V1为测定时样品的用量(ml);
VT为样液的总体积(ml);
FW为样品鲜重(g);
1.5过氧化物酶(POD)活性的测定
按刘萍和李明军的分光光度法测定POD活性[10]。具体方法:
1.5.1酶液的制备:
称取玉米根部0.5g剪碎,置于研钵(预冷)中,加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆,将匀浆液全部倒入离心管中,以3000r/min离心10min,上清液倒入25mL容量瓶中,残渣再用5mL磷酸缓冲液提取2次,上清液并入容量瓶中,定容至刻度,低温下保存备用。
1.5.2酶活力的测定
(1)取两只试管,均加入0.05mol/L磷酸缓冲液2.9mL,2%H2O21mL和0.05mol/L愈创木酚1mL,然后在其中一支试管中加入0.1mL酶液,在另一只试管中加入0.1mL在沸水中加热煮沸5min的酶液(作对照)。立即于37℃水浴中保温15min,然后迅速转入冰浴中,并加入20%三氯乙酸2mL终止反应。
(2)以5000r/min离心10min,收集上清溶液并适当稀释。
(3)用722型分光光度计,在470nm下测定2支试管中反应液的吸光度值。
1.5.3计算结果
以每分钟吸光度之变化0.01为一个过氧化物酶活力单位,计算过氧化物酶的活力与比活力。
酶活力(0.01△A/min)=△A/0.01t×D
酶的比活力[0.01△A/(g/min)]=△A/(0.01t×W)×D
式中△A为反应时间内吸光度值的变化;
t为反应时间(min);
D为稀释的倍数,即提取总酶液为反应液内酶液的倍数;
W为样品的鲜重(g);
1.6抗坏血酸氧酶(APX)活性的测定
按刘萍、李明军的比色法测定APX活性[11]。具体方法如下:
1.6.1 酶液的提取
取植物材料2g,剪碎置于研钵中,加少量石英砂及PH6.0的磷酸缓冲液,在低温下迅速研磨成匀浆。把匀浆液用缓冲液冲洗入50mL容量瓶中,并用PH6.0的磷酸缓冲液定容到刻度。放在18℃~25℃水浴上浸提30min,中间摇动数次,将上清液倒入洁净的三角瓶中备用。
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