植物非组培遗传转化的研究+文献综述(2)
1 非组培遗传转化的优势
受体系统的组培依赖性，操作复杂、费用高、周期长；某些双子叶植物及大部分单子叶植物组培难度大、品种依赖性强。如一些大豆品种和小麦等；多代组培与筛选处理易引起受体组织的突变，影响转化的目的性和真实性； 转化植株中常出现基因沉默，从而大大降低目的基因的表达效率。
非组培转化就是不经组织培养和植株再生直接获得转基因种子的遗传转化技术，是对传统转化技术的革新与优化。它具有以下优点：因为避开了组织培养环节，所以不受物种和组织器官的限制；既适合农杆菌介导的转化，也适应基因枪导入的转化方式；操作简单、成本低、周期短；避免受体组织的突变，保障了转化的目的性和真实性。
2 应用中的非组培转化技术
根据农杆菌接种或基因导入所以选择植物器官的不同，将它们分为以下几类方法：
2.1 农杆菌真空渗透法
该方法的发展经历了三个阶段：1)最初在拟南芥中直接将种子与农杆菌共培养，待植株成熟后收获种子，而后进行抗生素筛选、鉴定(Feldman and Marks, 1987)。在大豆中，用注射器将农杆菌直接注入种子的胚轴、子叶及子叶与胚轴的连接处，也获得了转化植株(Chee et a1., 1989)。这种方法的缺点是转化效率低(<0.5％)，可靠性和可重复性差。2) “剪涂” 法，这种方法主要适用于拟南芥。主要步骤为：剪掉主花序，将农杆菌菌液涂于花中央，几天后剪掉次生花序再涂菌液，如此反复多次，待长成植株收获种子后筛选、检测转化株(Charig et a1., 1994；Katavic et a1., 1994)。这种方法较前一种方法可靠，但操作繁琐。3)真空渗透法。Beehtold等(1993)，首先在拟南芥的转化中获得成功。该方法主要步骤为：在开花早期将花浸入含农杆菌菌液的液体培养基， 然后用真空泵抽真空处理再恢复常压， 使农杆菌菌液深入到植物组织内部。真空处理之后植株处于一种极度衰弱的状态， 需平放于高湿环境中进行恢复性生长，然后转栽于正常生长条件，收获种子筛选、检测转基因植株。真空渗透法操作简便，转化效率较高(>1％)。此法在拟南芥和其他一些植物中获得成功。例如，Liu 等 (1998)将该方法应用在北方小油菜(Brassicac campestris L. ssp. chi nensis)中获得转化植株；Trieu 等 (2000)在豆科植物百脉根(Medicago truncatula)上获得成功。与拟南芥不同的是，在百脉根转化中不但可对花进行真空渗透，还可对幼苗进行真空渗透，转化效率相当高(2.9％～76％)，但大部分是多拷贝转化。对幼苗转化获得成功的事实说明，百脉根被转化时植株的发育阶段早于拟南芥。Ronde 等 (2001)将大豆种子萌发，与农杆菌共培养一段时间后，抽真空，再将种子种于温室，长成植株后收获种子检测转基因后代，也获得转化植株。在上述实验中，植物发育阶段、抽真空的强度和时间、农杆菌的浓度都对转化效率有影响。
2.2 农杆菌花蕾渗透法（蘸花法 Floral-dip）
将植株花蕾期花序直接浸渍在带有载体的农杆菌菌液中，经表面活性剂的吸附和渗透作用，强化和刺激细胞的转化。经过生殖生长后，将获得的种子进行筛选从而获得转基因后代。该浸蘸法后来又发展为花喷雾法(floral-spray)。优点：操作简单、转化效率和重复率高，技术成熟。目前拟南芥功能基因组研究中大都采用该转化方法。转入基因：大量拟南芥功能基因。缺点：易得多拷贝转化。应用的植物：拟南芥、玉米、油菜、大豆、百脉根等。
在真空渗透法的基础之上又在拟南芥中发展了浸蘸法(floral dip)和喷洒法(spray)。这两种方法只需将农杆菌菌液与植株的花接触而不需要进行真空处理。所不同的是，在菌液中加入一种表面活性剂物质Silwet L-77。Clough 和Bent(1998)首先在拟南芥中用浸蘸法转化获得成功。他们把真空渗透法与浸蘸法作了对比，发现在菌液中加入Silwet L-77后，抽真空对于转化效率影响不大；浸蘸转化过程中加入Silwet L-77与未加入Silwet L-77的处理相比，转化效率差别很大(Clough and Bent，1998)。研究还发现，用浸蘸法转化拟南芥时，农杆菌液体培养基中除加入Silwet L-77外只需再加入蔗糖即可达到较好的转化效果。另外，转化操作时拟南芥的发育阶段对转化效率影响也很大，一般以开花前5～10天为宜。农杆菌菌液浓度对转化效率影响不大。Curtis和Hong (2001)采用浸蘸法对萝卜(Raphanus sativus L．longipinnatus Bailey)转化也获得了成功。他们在比较了植物发育的不同时期对转化效率的影响后发现，主花序的转化效率最高。在Pluronie F-68、Tween 20及Silwet L-77等3种表面活性物质中，Silwet L-77的效果最好。浸蘸法转化大大简化了拟南芥的转化程序，对其它物种的遗传转化也有很好的借鉴价值。2.3 花粉管通道法
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