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2.1生防菌的来源

本实验菌株筛选自黄瓜生境，对黄瓜霜霉病具备一定防效的菌株，编号分别为DS22和DYW14。

2.2黄瓜叶片来源

本实验黄瓜品种为温室条件下培育的“津优35”。

黄瓜栽培方法：将黄瓜种子进行表面消毒（70%无水乙醇表面消毒1-2 min，0.05%次氯酸钠溶液浸泡10 min，灭菌水润洗5次），播种于育苗盘中后放置于28℃，16/8 h光周期，70%相对湿度以上温室中进行培育。待黄瓜苗长到3-4片真叶（25 d左右）时进行移栽。将黄瓜幼苗移栽入装满基质的盆钵（上口外径14.7cm，上口内径12.8 cm，底径9.3 cm，高11 cm）中，每钵一株，置于28℃，85%相对湿度以上，16/8 h光周期温室。

 2．3叶围定殖试验

2．3.1抗生素标记菌株的获得

分别配制抗生素浓度为20、50、100 μg/mL的梯度平板，对试验菌株DS22、DYW14、进行天然耐药性检测。根据天然抗药性检测结果（表1）， DS22、DYW14、对利福平抗生素在试验浓度下均不具天然抗性，因此均可作为菌株标记用。 

表1 生防菌株对不同抗生素的耐性（抗生素浓度单位：μg/mL）

抗生素

antibiotic 无抗生素 卡那霉素Kan 链霉素Str 氨苄霉素Amp 氯霉素Chlo 利福平Rif

0 20 50 100 20 50 100 20 50 100 20 50 100 20 50 100

DS22 十 — — — 十 — — — — — 十 十 十 — — —

DYW14 十 十 十 — 十 十 十 十 十 十 十 十 十 - — —

注：“+”表示生长良好；“-”表示没有生长。

2.3.2利福平抗性菌株的制备

挑取野生型菌株单菌落至LB培养液中摇菌培养24 h，得到的菌液涂在含1μg/ml利福平的平板上培养，挑取单菌落（Rif1）至含1μg/mL利福平的LB培养液中摇菌培养24h，得到的菌液涂在含2.5μg/mL利福平的平板上培养。重复上述步骤，直至菌株抗性标记至100μg/mL。纯化，并经过多代培养以稳定其性状后保存，备用。