冰核基因2拷贝串联重复细胞表面展示体系的构建(3)
1.1.2冰核蛋白的作用机制
目前对于冰核蛋白是如何结合到细胞膜相应位点上，并如何聚合成冰核蛋白复合物及如何表现出冰核活性等问题仍在进一步的探索之中。N 端单一序列结构域含有几个较疏水片段，可能与冰核蛋白在细胞外膜上的定位有关。
1.2 细菌细胞表面展示技术概述
细菌细胞表面展示通常指通过DNA重组技术，将某一具有特定功能的外源蛋白的编码基因与受体细菌细胞表面的锚定单元（anchoring motif ）的编码基因融合后，通过融合蛋白在受体细胞中表达、分泌以及与细胞表面特定结构成分之间的识别，所表达的融合蛋白可以克服某些大分子底物不能直接穿越细胞膜进入细胞内反应位置，以及某些反应物在胞内无法正确折叠等弊端。细菌细胞表面展示技术已逐渐发展成为蛋白质应用的新技术。细胞表面展示的外源蛋白能与细胞外环境中的特定反应底物直接接触并发生作用，从而大大提高反应效率；同时，通过设计简便的胞外制备流程即可提取反应产物，从而免去某些产物通常不得不从细胞内提取与纯化等一系列负载低效的操作流程[1]。
近几年，研究者开始利用细菌冰核蛋白进行细菌细胞表面展示。细菌冰核蛋白(Ice nucleation proein, INP)是一种外膜蛋白，其C端暴露在细胞外膜上，因此，融合到INP-C端的外源蛋白即位于细胞表面上。此外INP在细菌培养物达静止生长期时仍可稳定存在，INP基因中部的重复区对DNA重排有较强的抗性，能抵抗DNA重排而正常表达冰核活性 ，这样用INP作细菌细胞表面展示时，可同时利用简捷、灵敏的冰核活性测定（即冰核基因活性表达的测定方法）来间接检测异源基因的表达，这些特性使INP成为一种理想的锚定基团在细菌细胞表面展示上应用[4]。用冰核基因产生的缺失INC的冰核蛋白在大肠杆菌中实现对折叠的蛋白质肽结构的展示，从而完成了对丙型肝炎病毒的核心抗原的表位图形的制作[7]。
细菌细胞表面展示在细菌表面多肽文库的构建与筛选，抗原在非致病细菌细胞表面表达，环境中有毒物质的讲解、口服疫苗、生物传感器等多方面显示出良好的发展潜力[2]。
1.3 冰晶核蛋白的细胞表面展示研究进展
INP作为细胞表面展示的载体蛋白，与其它载体蛋白相比较，具有以下优点：一、INP分子结构本身具有分泌、引导定位和固着细胞表面三重功能，无需辅助蛋白。二、中间重复单元结构可以根据需要加以取舍而不影响融合蛋白的表达，可以携带较大分子量的乘客蛋白。目前成功用于细胞表面展示的除了整个INP序列外还包括N-、C-末端以及中间若干重复序列构成的N末端-重复系列-C末端锚定单元，N-、C-末端融合构建的锚定单元和仅用N末端构建的锚定单元[12]；三、可在多种不同种属宿主细胞的生长稳定期稳定表达，不易被细胞内外的蛋白酶降解，其表达的融合蛋白在宿主细胞表面展示效率高。此外，目前尚未有阻碍宿主细胞生长或影响乘客蛋白活性的报道。
目前，INP已用来展示不同种类的外源蛋白并应用于多个研究领域，以INP构建的细胞表面展示体系越来越引起广泛的研究兴趣。
1.3.1 报告蛋白展示
用于INP细胞展示体系的报告蛋白通常为绿色荧光蛋白GFP，该蛋白具有易检测，稳定性高，不易被降解，对宿主细胞的生长代谢无影响，与多种蛋白融合对其结构、活性影响不大等优点。报告蛋白为研究展示体系在各宿主菌中的展示性能提供了依据。通过GFP蛋白的展示证实了仅以INP蛋白的N末端为锚定单元即可在大肠杆菌、恶臭假单胞菌和鳗弧菌等细菌细胞表面高效展示外源蛋白，从而进一步缩小了锚定单元的大小。此外，GFP与INP的N-、C-末端融合构建的融合蛋白能够展示于蓝藻细胞的周质空间，为研究蓝藻细胞的周质空间与环境之间的关系提供了良好的技术平台[1]。这些展示都为以INP及其部分结构域构建展示体系在各领域中的应用提供了依据，打下了基础。