摘要：本工作选取马克斯克鲁维酵母作为表达系统，进行了里氏木霉外切葡聚糖酶基因（CBH2）的表达。通过人工合成外切葡聚糖酶基因，将其插入到表达载体 pKLAC1中，得到重组质粒 pKLAC1-CBH2。用 ScaII 酶对重组质粒进行线性化酶切，选取最终所需的基因片段，运用电穿孔的方法转化马克斯克鲁维酵母菌株。经过含 5 mmol /L 乙酰胺的 YCB 平板筛选后得到可以高效表达外切葡聚糖酶的马克斯克鲁维酵母菌株。并对产物进行了FPA酶活测定，结果表明外切葡聚糖酶基因（CBH2）在马克斯克鲁维酵母中成功表达。66509

毕业论文关键词：外切葡聚糖酶，马克斯克鲁维酵母，重组子筛选，FPA酶活

Abstract: This job has selected the Kluyveromyces marxianus as the expression system to implement the expression of exoglucanase genes(CBH2) of Trichoderma reesei. It has been inserted into expression carrier pKLAC1 to get the recombinant plasmid of pKLAC1-CBH2 through artificially synthesized exoglucanase genes. Recombinant vector was linearized and digested via ScaII and then transformed the Kluyveromyces Marxianus strain1 by electroporation method. After screened on YCB plate containing 5mmol/L acetamide, the Kluyveromyces Marxianus recombinants which can highly express the exoglucanase can be harvested. The FPA activity of the products were determined and the results indicated that exoglucanase genes have been expressed in the Kluyveromyces marxianus successfully.

Keywords：exoglucanase, Kluyveromyces marxianus, screening of recombinants, FPA activity

目   录

1  前言 5

1.1  外切葡聚糖酶概述 5

1.2  马克斯克鲁维酵母概述 6

1.3  课题目的 6

2  材料 6

2.1  菌株和质粒 6

2.2  工具酶和主要试剂 6

2.3  培养基及主要试剂配制 7

2.4  主要仪器及设备 7

3  方法 7

3.1  目的基因的获取 7

3.1.1  人工合成 7

3.1.2  提取含目的基因的质粒 9

3.1.3  双酶切获取目的基因 9

3.2  表达质粒的克隆 10

3.2.1  TSS一步法制备大肠杆菌感受态 10

3.2.2  KCM法转化大肠杆菌 10

3.2.3  提取表达质粒 11

3.3  重组质粒 11

3.3.1  目的基因与表达质粒的连接 11

3.3.2  重组质粒的克隆扩增 11

3.4  重组质粒的转化及重组菌的鉴定 12

3.4.1  重组质粒的线性化处理 12

3.4.2  马克斯克鲁维酵母感受态的制备 12

3.4.3  电击转化及筛选 13

3.4.4  重组子酶活力测定及蛋白纯化 13

4  结果与分析 13

4.1  目的基因的获取