4.2  表达质粒pKLACI的提取 14

4.3  重组质粒的构建及验证 14

4.4  FPA酶活测定及蛋白纯化 16

结论 17

参考文献 18

致谢 19

1 前言

1.1  外切葡聚糖酶概述

纤维素酶是一种重要的酶产品，随着生物技术的高速发展，在扩大食品工业原料，提高原料利用率，净化环境和开辟新能源等方面具有十分重要的意义，且有望解决自然界不断产生的固体废物问题。是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，具有极好的发展前景。论文网

纤维素酶是一组复合酶的统称，主要包括内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和β—葡萄糖苷酶，上述三种酶通过协同作用将纤维素转化成葡萄糖[1]。木质纤维素中纤维素主要以结晶状态存在，而外切葡聚糖酶是唯一对结晶纤维素起作用的纤维素酶，在木质纤维素降解成还原糖的过程中，外切葡聚糖酶起着非常关键的作用[2]。因此外切葡聚糖酶基因的克隆表达，对于研究纤维素酶的降解机制有着十分重要的意义。文献综述

1.2  马克斯克鲁维酵母概述

马克斯克鲁维酵母是目前研究较为广泛的一种非传统酵母，因其耐高温、能量损耗低、生长速率快、染菌机率低、底物谱广等诸多优势而越来越多地应用于工业生物技术领域。         

马克斯克鲁维酵母可以分泌菊粉酶、β-半乳糖苷酶等多种应用广泛的水解酶类；还可以利用菊粉类原料、乳清、糖蜜以及木糖等多种非粮底物生产乙醇；其在外源蛋白的分泌以及基因工程操作等工业分子生物学领域也取得了突破。

总而言之，相比传统酵母,马克斯克鲁维高温酵母具有良好的耐温适应能力、更宽泛的底物利用能力、良好的发酵性能、超强的分泌能力、适于分子生物学操作等优势。

1.3  课题目的

本课题则是通过基因工程的技术，人工合成里氏木霉的外切葡聚糖酶基因，导入马克斯克鲁维酵母中, 利用酵母生长快、蛋白分泌能力强、易于培养等特点[3]，使外切葡聚糖酶基因能够在常温和短时间内快速、超量表达，达到降低能耗和提高经济效益的目的，为大规模发酵及工业应用奠定基础。

2  材料

2.1  菌株和质粒

研究所用的基因由青兰生物公司合成；表达质粒pKLAC1，马克斯克鲁维酵母种子液从外部购买；感受态由大肠杆菌DH5a由本实验室保存。

2.2  工具酶和主要试剂

限制性内切酶EcoR I、Not I、ScaII和T4 DNA Ligase购自纽英伦生物技术（北京）有限公司

DNA Marker DL2004D、和 质粒小量制备试剂盒（离心柱型）以及Genclean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）购自上海捷瑞生物工程有限公司。 

2.3  培养基及主要试剂配制

LB 培养基：酵母粉5 g /L，蛋白胨10 g /L，NaCl 10 g /L。

YCB培养基[4]： pH 7. 0的磷酸钠缓冲液30mmol /L，酵母基础碳源1. 1%，琼脂2%，乙酰胺5mmol /L

YPG 培养基：酵母粉10 g /L，蛋白胨20 g /L，α-乳糖 20 g /L。

5*KCM：0.5M KCL、0.15M CaCl2过滤除菌

2.4  主要仪器及设备来.自/优尔论|文-网www.youerw.com/

2S-75HJ型高压灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司

HH-S恒温水浴锅：金坛市亿通电子有限公司