2  实验材料、仪器和试剂

2.1  材料

干酵母

2.2  仪器

分光光度计、恒温水浴锅、移液器、试管、研钵、锥形瓶、试管夹、烧杯、移液枪

2.3  试剂

蔗糖、磷酸盐缓冲液、标准磷酸盐溶液、50 g/L三氯乙酸溶液、3 mol/L硫酸和25 g/L钼氨酸等体积混合液、α—1,2,4—氨基萘酚磺酸酸钠溶液。

3  实验方法

3.1  标准曲线的制作

取6支试进行编号，根据表1将钼氨酸-硫酸混合液、标准磷酸盐溶液、蒸馏水和α—1,2,4—氨基萘酚磺酸酸钠溶液分别加入6支试管中。充分摇匀后放入37 ℃恒温水浴锅中加热10 min。为使各管的无机磷和还原剂反应的时间严格一致，α—1,2,4—氨基萘酚磺酸酸钠溶液需实行加一管保温一管。从水浴锅取出试管后需冷却至室温，在波长为660nm下测定吸光值。

表1  标准曲线的制作

管号 标准磷酸盐溶液加入量/ml 含磷量/μg 蒸馏水/ml 钼铵酸－硫酸混合液/ml α－1，2，4－氨基萘酚磺酸钠溶液/ml 37℃水浴保温10min，冷却至室温 A660nm

1 0 0 3.0 2.5 0.5

2 0.2 5 2.8 2.5 0.5

3 0.4 10 2.6 2.5 0.5

4 0.6 15 2.4 2.5 0.5

5 0.8 20 2.2 2.5 0.5

6 1.0 25 2.0 2.5 0.5

试验重复6次，取平均值，以含磷总量为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3.2  酵母发酵

称取适量干酵母放入研钵中研磨（酵母质量分别为0.5 g、1 g、1.5 g），再加入1.5 ml蒸馏水混匀搅拌成酵母泥。将搅拌好的酵母泥放置于-20 ℃的冰箱里深冻处理24 h[5]。24 h后取出，将深冻处理的酵母泥用研磨棒研碎，加入1 g蔗糖继续研磨，直至充分接触混合。再加入3.5 ml 蒸馏水和5 ml磷酸盐溶液研磨成匀浆。将匀浆转移至50 ml锥形瓶中并立即取出0.5 ml均匀的悬浮液，加入到已盛有3.5 ml三氯乙酸溶液的试管中，摇匀，作为试样1。将锥形瓶放入37 ℃恒温水浴中，每隔30 min取出0.5 ml悬浮液，立即加入已盛有3.5 ml三氯乙酸溶液的试管中[4]，摇匀。共取四次，作为试样2，3，4、5。将所得到的试样3000 r/min离心10 min，得无蛋白滤液备用[2]。（注意：在每次吸取悬浮液前，将锥形瓶中的混合物充分摇匀。）来!自~优尔论-文|网www.youerw.com