传统常规的品种选育方法育种时间长并且工作量较大，杂交后代并不能立即显现出母本优良性状，需要进行优良品种的多代择优配种选育，最终才能得到在生产性状上较为优良的品种。这种传统的育种方式还会导致新性状品种的引入与原有性状保持之间的矛盾，不利于新品种的引入[6-8]，因此常规方法在短期内很难改变我国肉牛产业。相对常规的选育方法，现代分子育种技术逐渐成熟完善，研究人士对我国黄牛遗传特性的认知也有了更为深入的了解，通过以基因标记为核心的现代分子育种技术与常规育种方法相结合的方式运用于我国高品质肉用黄牛的选育中。分子育种技术相比传统的育种技术，能够有效缩短育种年限并大大提高育种效率，为中国黄牛品种资源的开发和利用，以及优质生产性状的选育，并能为提高寻找相应的分子标记等提供科学依据[6-8]。Khan 等(2007)和吴夏等(2007)的研究表明，线粒体基因组(mtDNA)呈现母系遗传的特点，后代线粒体DNA均来自于母本。其中线粒体16S rRNA基因在生物中普遍存在，且其功能相同，序列相对保守，是一个理想的遗传标记，被誉为“分子钟”[9]。 本研究主要采用PCR-SSCP技术结合DNA测序技术通过“分子钟”线粒体16S rRNA来寻找黄牛的突变位点以期选育出优良品种。

2材料与方法

2.1实验动物

共采集了124头秦川牛的血样，进行全基因组DNA的提取，最终得到78个DNA有效样品，用所得样品进行DNA扩增mtDNA16S rRNA目的基因片段。

2.2实验药品和试剂文献综述

主要溶液与缓冲液的配制所需的超纯水要通过高压蒸汽灭菌121℃，灭菌30 min。

表2-1实验药品和试剂

普通试剂 样品保存 全基因组提取 琼脂糖凝胶电泳 PCR-SSCP

柠檬酸，柠檬酸钠，葡萄糖，NaCl，十二烷基硫酸钠(SDS)，HCl，乙二氨四乙酸二钠(EDTA)，NaOH，三羟甲基氨基甲烷(Tris·Cl)，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Tris饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，醋酸钠，蔗糖，核酸染料，溴酚蓝，二甲苯氰，甘油，丙烯酰胺

抗凝剂ACD

PBS缓冲液，1 mol/L Tris·HCl ，DNA抽提缓冲液（STE），蛋白酶 K，NaAc缓冲液 10×TBE缓冲液，0.5×TBE缓冲液，Loading Buffer（上样缓冲液） 30 % 丙烯酰胺，10 % APS（过硫酸铵），变性剂，染色液，显色液

2.3仪器设备 

实验所用到的主要仪器设备。

表2-2主要仪器设备

2.4实验方法

2.4.1 血样的采集和数据的收集

采用随机采样的方法，采取牛静脉血20～40 mL，加入抗凝剂ACD（抗凝剂：血样= 1 : 6），编号后，用冰盒保存带回实验室，于超低温冰箱中-80 ℃长期保存备用。

2.4.2 生长性状数据的获得来!自~优尔论-文|网www.youerw.com

秦川牛共测量了体高、体长、胸围、腰角宽、坐骨端宽、尻长、十字部高、胸深、胸宽[7]等9个生长性状用于实验后期数据分析。

2.4.3 全基因组DNA的提取 

全血中基因组DNA的提取方法主要参考Chen H[10]方法。

2.4.4 DNA的质量检测

 DNA琼脂糖凝胶电泳检测

表2-3 1%琼脂糖凝胶制作表

规格 6×6规格胶板 6×12规格胶板 12×12规格胶板

浓度% 1