c 仪器:灭菌的研钵、1.5 mL EP管、镊子、电泳仪。

d 方法:

①:灭菌的研钵中加入2/3药用酒精,让其燃烧,冷却后,液氮预冷。称取0.2 g于-80℃保存的番茄组织置于已经预冷的研钵中,用研杵不断研磨,在研磨过程中不断添加液氮以防止RNA降解。直至样品被研磨成粉状,肉眼无法看见颗粒。(整个操作过程中需戴一次性口罩与手套,防止外界RNA污染样品);

②:将做好标记的1.5 mL的离心管放在液氮中预冷后,用镊子取出。利用预冷后的药匙将研钵中的样品装入到 1.5 mL的离心管中。再将离心管置于液氮中,直至下一个步骤开始;

③:在试管中加入1.0 mL Trizol,摇匀,15~30℃静置5 min;

④:离心机预冷到4℃,离心管置于离心机中12000 r/min离心10 min。取930 μL上清转移到新的1.5 mL无RNA酶的离心管中(离心管管盖上做好标记);

⑤:离心管、氯仿分别置于通风厨中,在通风厨中工作。向离心管中添加200 μL氯仿,剧烈振荡15 s。常温静置3 min后,将离心管置于预冷至4℃的离心机中,12000 r/min离心15 min。取上清350 μL置于新的1.5 mL离心管中并标记;

⑥:加入350 μL异丙醇,混匀,常温静置10 min。4℃,12000 r/min,离心15 min,倒掉上清,离心30 s;

⑦:加乙醇1 mL,颠倒几下,12000 r/min离心5 min;

⑧:吸出上清,再离心1 min;吸出余下的上清,晾干。保证乙醇挥发。加20 mL DEPC水,移液枪将其混匀。吸取2 mL置于小的离心管中。置于冰上,电泳备用;

⑨:1×TAE电泳缓冲液配置1.5%的琼脂糖凝胶,加核酸染料,倒胶,待其充分凝结后,取3 μL提取的RNA样品,与溴酚蓝混匀后点样,检测其完整性。另取1 μL样品,紫外分光光度计法测其在260/280 nm处的光吸收值,测定其纯度。将检测合格的样品置于-80℃保存备用。来!自~优尔论-文|网www.youerw.com

2.2.2番茄总RNA反转录

a 取材:提取出的番茄总RNA。

b 试剂:解链PCR体系(Olig(dT)18(10μM) 2 μL,模板RNA 1 μL,Add ddH2O to 11 μL),反转录PCR体系(5×M-MLV buffer 4 μL,10 mM dNTPs 2 μL,M-MLV(200U/μL) 1 μL,ddH2O 2 μL)。

c 仪器:PCR扩增仪,1.5 mL离心管。

d方法:

①:向离心管中加入11 μL的解链PCR体系(整个实验过程中佩戴一次性手套与口罩);

②:在PCR扩增仪中70℃环境下解链10 min后取出,置于冰上5 min;

③:向离心管中加入9 μL反转录PCR体系后,在PCR扩增仪中42℃环境中60 min,后继续70℃10 min。-20℃保存待用;

2.2.3 SlERF26基因的引物合成及其基因全长的克隆

a 取材:反转录后的cDNA

b 试剂:PCR扩增体系(H2O 33 μL,KOD Buffer 5μL,dNTP(2mM) 5μL,MgSO4 3μL,cDNA 1μL,KOD酶1 μL,前引物1 μL,后引物1 μL,)。

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