接种量 人为控制接种浓度

1.1重组大肠杆菌生产肠激酶研究现状

  商品化的肠激酶主要有2种：天然提纯的牛肠激酶和基因工程重组牛肠激酶[2]。因为基因工程重组牛肠激酶具有全酶酶切特异性并且表现出较强的对基因工程融合蛋白底物的酶切活性，所以现在多采用基因工程的方法生产肠激酶[3]。现在一些生产公司都是从市场上购买基因重组的大肠杆菌种子进行发酵培养、诱导，通过对各种条件的控制，使重组大肠杆菌积累众多的特殊的生物大分子——包涵体（inclusion body）。然后利用各自不同的处理方式进行处理，并最终得到目的产物肠激酶。由于菌种对于生长环境要求近乎苛刻，所以对于大肠杆菌的发酵生产，需要注意的方面很多。生产胰岛素的发酵控制和后处理不同于实验室和试验工厂，这也是规模发酵生产的很重要的特征。

1.2研究目的及主要内容

肠激酶可以识别胰蛋白酶原的DDDDDK位点并切除，使其变成有活性的胰蛋白酶。和一般的生理生化反应相比，这个反应非常迅速高效，而且肠激酶作用后的胰蛋白酶，结构不会改变，完全忠实于自然蛋白。所以肠激酶在分子生物学的研究和制药工程等领域的地位非常重要[4]。因为市售的肠激酶价格昂贵、获得途径单一、传统的从十二指肠组织提取的肠激酶容易受污染[5]。所以利用基因工程重组大肠杆菌生产肠激酶有很好的市场前景[6]。

本论文的主要目的就是通过对发酵工程发酵培养重组大肠杆菌生产肠激酶的工艺流程中的影响产物产量的结果进行优化，旨在得到最优的发酵生产工艺，以提高肠激酶的产量。对于温度的优化，对各温度进行分析研究，得出不同温度得到的产量。分析后得到最优的培养温度；对于接种量的研究主要研究了二级种子接种量和发酵罐的接种量对于发酵菌种浓度的影响；对于补料时间，本论文研究并得出了最优的补料时长，在此补料时间下，菌种在诱导前获得了最高的菌体浓度；对于诱导点的选择，研究不同的诱导点对于包涵体积累量的影响，得出最优的诱导点。

2 材料和方法

2.1 试剂

表2-1 常用试剂

酵母粉 琼脂粉 Solution II

蛋白胨 卡那霉素 Solution III

NaCl SolutionI（加入RNaseA） W1 Solution

Wash Solution NaOH Loading Buffer

Elution Buffer Buffer CBS 核酸染料花青素

TAE缓冲液 NdeI#R0111s酶 Marker

Tris BamHI#R0136s酶 乳糖发酵培养基

冰乙酸 CutSmart 结晶紫染液

卢戈氏电液 葡萄糖 七水硫酸镁

95%乙醇 十二水磷酸氢钠 氯化钙

番红 磷酸二氢钾 甲硫氨酸

二甲苯 硫酸铵 磷酸

氨水 IPTG