②灭菌：高压蒸汽灭菌锅、121℃,30min，冷却至45℃左右

③倒平板：取100ml就培养基,倒成5个平板，放置凝固；取100ml，称取8mg卡那霉素，溶解过滤加入培养基，然后轻轻摇匀，倒成5个平板；

④用接种环将稀释好的菌液均匀的涂到固体培养基上；

⑤在37℃隔水式恒温培养箱中培养12-24h；文献综述

观察固体培养基中菌体的菌落形态进行对比。

2.4.2重组大肠杆菌重组基因稳定的检测

（1）质粒提取实验

1、质粒提取实验方法和步骤

①先用CBS Buffer 平衡DNA 吸附柱：向DNA吸附柱中加入200µlCBS buffer，然后用离心机1200rpm离心一分钟左右，然后倒去废液，吸附柱待用。

②取过夜菌液4ml，8000rpm离心1分钟，去上清。

③加500µl SolutionI，用枪头或者振荡器震荡，充分混匀菌液[8]。

④向菌液中加入500µl SolutionII，轻轻上下混合，直到菌体呈透明蛋清状。时间不宜过长。

⑤向菌液中加入700µl SolutionIII ，温和并充分地上下翻转混合30秒，室温静置5分钟。再用离心机12000rpm，离心10 分钟 。（solutionI、solutionII、solutionIII加量成5:5:7的比例）

⑥DNA吸附柱置于2ml套内，再将（5）中的上清液转移到DNA 吸附柱中，室温6000rpm 离心1分钟，取出DNA 吸附柱，去废液。

⑦加500µl W1 Solution，12000 rpm，室温离心1分钟，弃废液。

⑧加500µl Wash Solution ，12000 rpm，室温离心1分钟，弃废液。

⑨加500µl Wash Solution，放置2分钟，再次离心。     

⑩弃废液，12000rpm，室温离心10分钟，彻底除去Wash Solution，开盖室温放置5分钟，使吸附柱中残留的漂洗液完全晾干挥发。在DNA吸附柱膜中央加入50µl-100µl Elution Buffer，37°C放置2分钟，12000rpm，室温离心1分钟，离心管中的液体即为质粒溶液[9]。取1-3µl进行琼脂糖凝胶电泳检测，纯化好的DNA可立即用于后续试验或-20°C保存备用。

（2）质粒酶切实验

取50µl上述提取的质粒提取液加入3µlNdeI、3µlBamHI（两种酶量不超过总体积的10%）、7µlCutSmart（总体积的10%），加纯化水定容至70ml，上下翻转充分混合，37℃水浴放置1.5h-2h。将酶切后和酶切前的质粒放到层析柜保存待用。

（3）琼脂糖凝胶电泳实验

1、检查仪器，正确制备合适的凝胶备用。

2、组装仪器，添加缓冲液，混匀待测样品和Loading Buffer，上样。电泳，指示剂距凝胶前沿大约3cm，停止电泳。将凝胶剥离出来，置于紫外分析仪下观察、拍照。

2.4.3 重组大肠杆菌生长曲线的测定来!自~优尔论-文|网www.youerw.com

（1）生长曲线测定的步骤和方法

1、取酵母粉2.0g（2.0%），葡萄糖0.2g（0.2%），Nacl1.5g（1.5%）配制成LB培养基。将配置好的培养基分装于10个50ml锥形瓶中，以封口膜封口；取6.0gNacl，10g酵母粉，1g葡萄糖配制成二级培养基，分装于两个1L的锥形瓶中，封口膜封口。将一级、二级培养基置于灭菌锅中，121℃，灭菌30min。

2、一级种子种子制备：从-80℃的甘油管中，取120µl菌种接种至10ml一级种子培养基中，30℃、300rpm,培养过夜。

3、二级种子种子制备：取10mL一级种子，接种至250ml锥形瓶中（4%的接种量）37℃，250rpm,培养4-6h,至OD600值大于3.5。

4、将活化好的二级种子（OD600＞3.5）以5%的接种量，接种至基础培养基（LB培养基）中，30℃、250rpm,培养，每隔1h测一次OD值，绘制生长曲线。