消泡剂

2.2 仪器

表2-2 常用仪器

隔水式电热恒温箱 超净工作台 恒温震荡器

紫外分光光度计 反应式摇床柜 离心机

PH计 30L发酵罐 琼脂糖电泳仪

微波炉 紫外检测仪 显微镜

恒温磁力搅拌器 循环式真空抽水泵 均质机

2.3 实验菌种

含有重组肠激酶的大肠杆菌

2.4 试验方法

2.4.1 生产肠激酶工程菌的鉴定

（1）大肠杆菌菌落实验

 1、接种培养：

①制备平板：将牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、NaCl 0.5g、琼脂1.5—2.0g、加水（小于100ml）、搅拌均匀，调PH至7.4-7.6，定容至100ml，转入锥形瓶内，封口；

②灭菌：高压蒸汽灭菌锅、121℃,30min，冷却至40℃左右；

③倒平板：取100ml培养基,倒成5个平板，放置凝固；论文网

④用接种环将稀释好的菌液均匀的涂到固体培养基上；

⑤在37℃恒温培养箱中培养12-24h；

 2 革兰氏染色观察菌落形态：

①在载玻片中央滴一滴蒸馏水，在无菌操作台上用接种针从大肠杆菌平板上取少量菌苔于水滴中，混匀，涂片成一层水膜

②在空气中自然干燥

③涂片朝上，通过火焰三次，以热而不烫为宜使细胞质凝固细胞形成固态粘附在玻片上

④在制片上滴加结晶紫染液，1min后，用自来水缓慢冲洗掉多余的染料

⑤滴两滴碘液，染色1分钟后，用清水缓慢冲去多余染料，动作轻柔

⑥脱色：滴加酒精，摇动玻片半分钟后用水缓慢冲洗

⑦滴加石炭酸复染液1分钟,水洗

⑧滤纸吸干，油镜镜检

 （2）大肠杆菌乳糖发酵实验

 1 大肠杆菌乳糖发酵实验方法和步骤：

①取乳糖发酵培养基加水配制成乳糖发酵培养基

②每个试管取5-6ml乳糖发酵培养基，将杜氏小管倒置放到试管内，用棉花塞上

③用牛皮纸将试管口包扎好，放到高压灭菌锅121℃灭菌30分钟。

④在无菌操作台中取大肠杆菌接种到四个试管中，第五个试管作为对照，置于隔水式恒温箱中培养。培养若干时间，在4h、5h、6h、7h、8h的时候进行观察。

 （3）、大肠杆菌甲基红实验

甲基红实验的方法和步骤：配制蛋白胨水培养基，蛋白胨1%，Nacl0.5%，分装之后灭菌，冷却，然后挑取平板上的大肠杆菌菌落接种到试管中，置于恒温培养箱中培养24小时。取出，滴加2-3滴甲基红试剂，观察试管培养液上层。阳性为红色，阴性为黄色。

（4）、大肠杆菌吲哚实验

配制蛋白胨水培养基试管三只，其中一个为空白对照。然后对另两个试管接种。挑取少量大肠杆菌菌苔到试管中，置于37℃恒温培养箱中培养24小时。加入乙醚，萃取吲哚，待乙醚层浮于培养液的上方，此时沿着试管壁加入吲哚试剂，若乙醚层为玫瑰红色，则为吲哚试验阳性反应，反之为阴性[7]。

（5）、大肠杆菌卡那抗性试验

卡那抗性试验方法和步骤

①制备平板：将牛肉膏0.6g、蛋白胨2g、NaCl 1g、琼脂2-3g、加水（小于100ml）、搅拌均匀，调PH至7.4-7.6，定容至200ml，转入锥形瓶内，封口。