4.讨论 18

5.参考文献 19

6.致谢 21

图清单

图序号 图名称 页码

图1 GL003701的系统进化树 11

图2 PCR产物电泳结果 12

图3 重组质粒筛选的电泳结果 13

图4 质粒简化图 14

图5 质粒的酶切位点 14

图6 质粒酶切的结果 15

图7 粗酶的表达 16

表情单

表序号 表名称 页码

表1 引物 12

引言对羟基苯甲酸(4-Hydroxybenzoate，4HBA)是一种有机合成原料，广泛应用于食品、医药、化妆品、电子等等方面。据悉，我国的4HBA在2002年的生产量已达到6000吨，并以11.4%的增速增长，在2014年我国的4HBA的生产值已高达20000吨[1]。4HBA主要有两个用途，第一，4HBA可用于4HBA酯类的合成，比如说有4HBA甲酯、4HBA乙酯、4HBA丁酯等等，4HBA酯类是现在运用最多的防腐剂[2]。第二，4HBA应用于合成液晶高分子上。4HBA可以从石油成分中合成出来，也可以通过植物和微生物的途径合成出来。生物合成芳香族化合物的一条重要途径就是莽草酸途径，该途径的最终产物分支酸经过一系列途径转化到4HBA[3]。

莽草酸途径是存在于植物、真菌和微生物中的一条重要的代谢途径，该途径有7个酶化过程，从而合成分支酸。葡萄糖可以经过糖酵解途径生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），同时也可以通过磷酸戊糖途径生成赤藓糖-4-磷酸（E4P），以上两种物质在3-脱氧-β-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP）合成酶的催化作用下进入莽草酸途径[4]。分支酸经过一系列的酶促反应合成酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，包括3个途径。首先分支酸裂解酶可以直接催化分支酸，从而生成4HBA[5-6]。其次可以通过苯丙素和CoA链连接成对羟基肉桂酸-CoA，在酶的催化作用下生成对羟基苯甲醛，再经过氧化的过程就可以得到4HBA了[7]。最后就是对羟基肉桂酸-CoA的非依赖途径[8-10]。论文网

无缝克隆（Seamless Cloning）[11]，和传统的PCR产物克隆方法有所不同，主要是在载体的末端和引物末端具有15-20个同源碱基，方法是在引物设计时，特意的加上15-20个和线性化载体末端相同的碱基序列，以此通过聚合酶链式反应扩增出来的目的片段能过和线性化的质粒载体通过同源重组进行高校紧密的连接。整个连接过程在无连接酶的的作用可直接转化进入感受态的宿主菌。无缝克隆作为一种简单快速的克隆方法，目前已经广泛应用于合成生物学，蛋白质组学，基因工程等相关技术领域。

1 材料

1.1  菌种与质粒

本实验所使用的保藏菌株为Microbulbifer sp. A4B-17 菌株。本实验的宿主菌为E. coli JM109菌

质粒：pcoldⅠ

1.2  分子生物学相关试剂

   （1）6 Loading Buffer：上海生工生物科技有限公司   

（2）Markers（DNA ladder）：上海生工生物科技有限公司