第一链合成产物 20

双蒸水 up to 50

1。5 UV视蛋白基因的克隆

1) 视蛋白UV基因的5＇RACE 实验步骤

通过特异性引物进行巢式PCR，引物是通过生物公司合成见下表

表1-1 UV巢式PCR引物

Tab1-1 UV Nested PCR primers

接头引物

5RACEP1 5’-GCATAGGTATCAACGCAGAGCCCCCCCCCCCCCCCC-3’

5RACEP2 5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’

特异引物

uv51 5’- ATGGAAACCATGGCCAACCATCTCGGTTG -3’

uv52 5’- TTAAGTCGTAGTCGTAGCACTTTGAGTTG -3’

第一轮PCR反应我们选取接头引物5RACEP1 5’- GCATAGGTATCAACGCAGAGCCCCCCCCCCCCCCCC -3’和特异性引物uv51 5’- ATGGAAACCATGGCCAACCATCTCGGTTG -3’两种按照表的反应体系进行加样：

成分 体积（μl）

TAQ plus DNA Polymerase（5 U/μl） 1

10×TAQ plus PCR Buffer 5

dNTP Mixture（各2。5 mM） 4

加尾产物 1

uv51（10pM） 2

F35H5R1（10pM） 2

灭菌蒸馏水 up to 50

PCR反应在BIOER PCR扩增仪上进行，95℃ 预变性5min，95℃ 变性40s，60℃ 退火30s，72℃ 延伸90s，35次循环，最后72℃ 延伸10min，取2μL扩增产物用0。75%（g/ml）含EB的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察并照相。

第二轮PCR反应我们选取接头引物5RACEP2 5’- GGCCACGCGTCGACTAGTAC -3’和特异性引物uv52 5’- TTAAGTCGTAGTCGTAGCACTTTGAGTTG -3’两种按照表的反应体系进行加样：

成分 体积（μl）

TAQ plus DNA Polymerase（5 U/μl） 1

10×TAQ plus PCR Buffer 5

dNTP Mixture（各2。5 mM） 4

第一轮PCR产物 1

uv52（10pM） 2

F35H5R1（10pM） 2

灭菌蒸馏水 up to 50

PCR反应在BIOER PCR扩增仪上进行，95℃ 预变性5min，95℃ 变性40s，60℃ 退火30s，72℃ 延伸90s，35次循环，最后72℃ 延伸10min，取2μL扩增产物用0。75%（g/ml）含EB的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察并照相。PCR产物电泳检测后,取适量纯化产物送至上海英骏生物技术有限公司进行PCR产物测序。