2  材料与方法

2。1  材料与试剂

2。1。1  实验试剂

“淮麦33”由淮安农科院顾正中研究员提供；胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）、RPMI1640培养、抗生素购于Gibco公司； RAW264。7 细胞购自 ATCC (Rockville,MD,USA)；其他试剂均为分析纯。免疫印迹法检测总蛋白或磷酸化形式蛋白含量中所用的特异性抗体细胞外信号调节激酶（ERK），c-Jun 氨基酸末端激酶(JNK)，p38, IB和actin 均购自 Cell Signaling Technologies (Beverly,MA, USA)和 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA,USA) 公司。抗体 iNOS、COX-2、β-actin 购于 Cell Signaling 公司；GAPDH、iNOS、COX-2 引物由上海捷瑞生物工程有限公司；微量 BCA 蛋白含量试剂盒、辣根过氧化物酶试剂盒、Nc -细胞核/浆蛋白抽提液试剂盒购于北京康为世纪有限公司；蛋白质 Marker 购于美国 NEB（New EnglandBiolabs）公司；Trizol 购于 Invitrogen 公司；文献综述

2。1。2  实验仪器

C2500-R 1。5 mL；2。0 mL 台式高速冷冻离心机：德国 Eppendorf 公司；TE612-L 电子天平：赛多利科学仪器（北京）有限公司；9700 PCR 扩增仪：ABI 公司；水平电泳槽：美国 Bio-Rad 公司；ALPHA 1-2LDPLUS 冷冻干燥机：德国 ALPHA 公司；ME254S(0。1 mg/250 g) 分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；GEL XP System 伯乐凝胶成像系统：美国 Bio-Rad 公司；Tanon 5200 Multi 数码凝胶图像处理系统：上海天能科技有限公司；二氧化碳培养箱：日本 SANYO 公司。

2。2  细胞培养及传代

RAW264。7 细胞购自 ATCC，用含青霉素（100 U/ml），克链霉素（100 gml）和 10%胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640 培养基置于 37℃、5%CO2 培养箱中培养，2~3d 更换新的培养基。当细胞融合率达到 80% 时对细胞进行继代培养。

2。3  RT-PCR检测 mRNA 表达水平

2。3。1  细胞总 RNA 的提取

取 RAW264。7 细胞（5×106/ml），加入 1 mL 的 TROzlo，将样品置于冰上 10 min，使核蛋白充分解离，加入 100 L 的氯仿，盖紧盖子，充分剧烈震荡 15 s 并与冰上静置 5 min，4°C 12000 g 离心 15 min，离心后样品分层，上层为 RNA，下层为蛋白质和 DNA。取上清 400 L，以1:1的比例加入异丙醇 400 L，混匀5次，室温下静置 10 min 后，在管底会出现胶状沉淀，即为 RNA，4°C 12000 g 离心10 min 后弃上清，向沉淀中加入 1 mL 75% 乙醇 DEPC 水，轻轻混匀；4°C 7500 g 离心5 min 后弃上清，将 RNA 样品晾干，加入 30 L DEPC 水溶解后放入超低温冰箱保存备用。

2。3。2  PCR 扩增

表1 引物列表

Tab 1 List of primers

引物名称 上游引物序列5’- 3’ 下游引物序列5’- 3’

GAPDH      CACTCACGGCAAATTCAACGGCACA GACTCCACGACATACTCAGCAC

iNOS CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAG GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTG

COX-2 CACTACATCCTGACCCACTT ATGCTCCTGCTTGAGTATGT

TNF-  TTGACCTCAGCGCTGAGTTG CCTGTAGCCCACGTCGTAGC

半定量 PCR 反应体系： 10 L2×Ex Taq、上下引物各 0。5 L、cDNA 2 L以及7 L蒸馏水混匀后置于 PE 管中。 GAPDH、COX-2 及 TNF-的扩增条件： 94°C、2 min→94°C、30 s，60°C、30 s，72°C、40 s（30个循环）→72°C、5 min。

    实时定量 PCR 检测反应体系：25 L 2×Ex Taq、上下游引物各1 L及9 L的蒸馏水。COX-2 的扩增条件：94°C、10 min→94°C、30 s，55°C、30 s，72°C、40 s（30个循环）→72°C、5 min。来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com