DPPH自由基的化学结构

本次实验采用分光光度计法，DPPH自由基清除计算公式一般为：

DPPH自由基清除率/%= ×100

式中：A 是没有加样品的DPPH自由基吸光度； 是已经加入样品的DPPH自由基吸光度。

2。3。2  Folin-Ciocalteu 比色法文献综述

     原理：由于 Folin-Ciocalteu 试剂中的钨钼酸能够将多酚化合物定量氧化，自身被还原（使W 6+变为W5+）生成蓝色的化合物，颜色的深浅跟多酚含量呈正相关，因此可以通过该比色方法来对多酚进行定量检测。

2。2。3  亚硝酸钠－硝酸铝－氢氧化钠比色法

     原理：在中性或弱碱性的条件下，将亚硝酸钠溶解于溶液中时,加入黄酮类化合物，会与钠盐发生反应生成螯和物,生成的螯合物再与氢氧化钠溶液反应，氢氧化钠使黄酮类化合物开环，生成 2’-羟基查耳酮，从而使溶液变成红橙色,在500nm波长处能够测得有吸收峰，与槲皮素标准系列比较确定含量。

2。4 实验步骤 

2。4。1 粗提取

     取已干燥的何首乌块根，用破碎机切碎，将叶子碎片用95%乙醇水溶液回流提取，总共提取三次，每次提取时间大约3h;将回流提取后的液体用旋转蒸发仪浓缩，所得即为总浸膏，取部分总浸膏，留存。其余部分用水溶解，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取，各萃取三次。（二氯甲烷、乙酸乙酯均为工业纯，经重蒸后使用；正丁醇为分析纯),将三种萃取液进行浓缩，分别得到浓缩过后的二氯甲烷相粗提取物、乙酸乙酯相粗提取物、正丁醇相粗提取物。将剩余水溶液浓缩，得到水相粗提取物。

2。4。2 DPPH法测抗氧化活性

    1。DPPH溶液的制备：精密称取DPPH粉末3。16mg，置于离心管内，用10mlL无水乙醇溶解，配成浓度为0。80 10 mol/L 的DPPH乙醇溶液，用黑色塑料包裹，放置于黑暗处保存，备用。

    2。维生素C清除DPPH自由基[18]的测定：精密称取维生素C1。0mg，置于离心管中，用1m无水乙醇溶解，配成浓度为1mg/mL的维生素C储备液。取维生素C储备液适量，分别加入无水乙醇，对照品溶液按浓度梯度逐步稀释成质量浓度分别为80、40、20、10、5μg/mL的维生素C系列。分别取上述各质量浓度维生素C对照品溶液50μL，与DPPH溶液150μL，均匀点在96孔细胞培养板上，放置30 min后，于515 nm处测定其吸光度A。参照公式“DPPH清除率=[1一(As一A空)／(A0一A空)]×100％”计算清除率。式中：As为样品与DPPH溶液反应后在515 nm处观测到的吸光度，A空为溶剂在515 nm观测到的吸光度。

    3。何首乌各萃取组分制备：分别称取二氯甲烷相粗提取物、乙酸乙酯相粗提取物、正丁醇相粗提取物，总浸膏16mg，置于离心管中，加入1mL甲醇溶液溶解，配成16mg/mL的试样。采用倍半稀释的方法将试样稀释得到8mg/mL、4mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0。5mg/mL、0。25mg/mL、0。125mg/mL、0。0625mg/mL的稀释试样。保存，备用。

    4。何首乌中不同萃取组分清除DPPH自由基能力测定：将3中所得到的不同的质量浓度试样品各50μL，分别加入DPPH溶液150μL于96孔细胞培养板上，放置30min，于515nm处测定其吸光度A。参照公式“DPPH清除率=[1一(As一A空)／(A0一A空)]×100％”计算清除率。式中：A为不同萃取组分与DPPH溶液反应后在515 nm处观测到的吸光度，A0为未加试药的DPPH溶液在515 nm观测到的吸光度，A空为溶剂在515 nm观测到的吸光度。以质量浓度为横坐标、清除率为纵坐标绘制何首乌不同萃取组分二氯甲烷粗提取物、乙酸乙酯粗提取物、正丁醇粗提取物，总浸膏对DPPH自由基的清除曲线。来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com