根围微生态重置是指通过轮作、微生态制剂、生物菌肥等方式主动调节植物根围微生物群落结构来构建一个有利于植物健康生长的微生态环境从而保证寄主的健康生长[3]。Zhu 等发现，健康大豆植株、被线虫侵染的大豆植株以及被线虫侵染植株同时接种Purpureocillium lilacinus YES- 2 菌株后，三者的根围细菌多样性存在明显差别[4]。因为在植物根围这个微环境中，土传病原菌能否形成有效侵染种群密度主要取决于它在和土著种群的竞争中能否占得优势，这在以往关于抑制性土壤的研究中广泛报道[5~7] 。论文网

本研究以实验室现有微生物菌剂作为研究对象，检测其在防治黄瓜枯萎病过程中对于黄瓜根围原有微生态的影响，从而为该菌剂的科学使用提供理论依据。

2  材料与方法

2。1  实验设计

本研究以设施栽培黄瓜作为研究对象，在黄瓜移栽时利用本实验室现有微生物菌剂“宁盾”进行灌根处理，并在移栽后1、2、3个月时分别采集黄瓜根围土壤进行检测。以未使用微生物菌剂的黄瓜作为对照组，处理组和对照组实验小区随机分布，每个处理3次重复，每个重复小区面积3*2m2。处理组分别标记为T0-1, T0-2, T0-3, T1-1, T1-2, T1-3, T2-1, T2-2, T2-3; 对照组分别标记为C0-1, C0-2, C0-3, C1-1, C1-2, C1-3, C2-1, C2-2, C2-3。

2。2  土壤采集方式

整个土壤采集过程采用三点取样法，每个小区等距离选取黄瓜植株三株，首先将黄瓜植株拔出，轻轻抖动以去除粘附的大量土壤，再利用毛刷轻轻刷下紧贴在黄瓜根部的根围土，三株黄瓜样品混合在一起，装入塑封袋放在冰盒中带回实验室，样品前期处理后研磨过2mm筛。进行土壤总DNA 的提取、进行PCR-DGGE分析，部分置于阴凉通风处自然干燥至恒重，用作土壤理化性质及酶活性检测。剩余的则置于-20℃冰箱保存备用。

2。3  微生物多样性检测方法

2。3。1  土壤DNA的提取

本实验是利用FastDNA SPIN Kit for Soil（MPbio，USA）试剂盒进行总DNA的提取用于变性梯度凝胶电泳分析（DGGE）。提取方法参照试剂盒实验说明。

2。3。2  细菌16S rDNA片段的PCR扩增

以样品基因组DNA为模板，采用细菌通用引物GC-338F和518R扩增样品16S rDNA高变区序列。

表1：本实验引物信息

Primer Sequence

338F CCT ACG GGA GGC AGC AG

518R ATT ACC GCG GCT GCT GG

GC338F CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGG

CCT ACG GGA GGC AGC AG

PCR扩增体系（50 μL）为：10× PCR buffer 5 μL；dNTP（2。5 mM）3。2 μL；rTaq（5 U/μL）0。4 μL；GC-338F（20 μM）1 μL；518R（20 μM）1 μL；模板DNA 50 ng；补ddH2O至50 μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性5 min； 94℃变性1 min， 55℃复性45 s，72℃延伸1 min， 30个循环；最终72℃延伸10 min。

PCR产物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit纯化回收。

PCR仪为Biometra公司生产的T-gradient，凝胶成像仪为Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝胶成像系统。

2。3。3  PCR产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析文献综述

取10 μL PCR的产物进行变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析。采用变性梯度为35%～55%、浓度为7%的聚丙烯酰胺凝胶在1×TAE缓冲液中56V 60℃下电泳14小时。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）完毕后、采用银染法染色、步骤如下：

a) 固定液（乙醇 50 mL、冰醋酸2。5 mL、定容500 mL）固定15 min；