b) Milli-Q纯水清洗、20 s和2 min各一次；

c) 银染液（硝酸银1 g、37%甲醛0。75 mL、定容500 mL）染色15 min；

d) Milli-Q纯水清洗、20 s和2 min各一次；

e) 显色液（氢氧化钠7。5 g、37%甲醛2。5 mL、定容500 mL）显色5-7 min；

最后用终止液（乙醇50 mL、冰醋酸2。5 mL、定容500 mL）终止反应。

2。3。4  DGGE图谱中优势条带的回收与测序

用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带，采用OMEGA 公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的条带。

以2 μL回收产物为模板，338F/518R为引物进行PCR扩增。

PCR扩增体系（50 μL）为：10× PCR buffer 5 μL；dNTP（2。5 mM）3。2 μL；rTaq（5 U/μL）0。4 μL；338F（20 mM）1 μL；518R（20 mM）1 μL；模板DNA 1 μL；补ddH2O至50 μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，55℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后，72℃延伸10 min。

将重新扩增的DNA片段切胶回收、纯化后，连接到Pmd18-T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行序列测定。

2。3。5  数据分析

细菌多样性指数是研究群落物种数和个体数以及均匀度的综合指标。根据电泳图谱中样品条带数目及每个条带的强度（灰度），对各样品中细菌多样性指数（H）、均匀度（E）和丰富度（S）等指标进行分析。DGGE图谱采用Quantity one软件对每个样品的电泳条带数目、条带密度进行数字化分析，香农指数（H）、丰度（S）和均衡指数（E）等指标被用来比较不同样品的多样性情况。其算法如下所示：来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*

H´=— 

E =H/Hmax =H/lnS

其中，pi为样品中单一条带的强度在该样品所有条带总强度中所占的比率，N为DGGE图谱单一泳道上所有条带的丰度，Ni为第i条带的丰度；S是某样品中所有条带数目总和。

将序列提交到GenBank数据库。在GenBank中使用Blast程序进行同源性比较，获得最相似典型菌株的16S rDNA序列。采用MEGA5软件，Neighbor-joining法构建系统发育树，自展数（bootstrap）为1000。

银染后的DGGE 图谱用BioRad GS800 光密度仪扫描，得到的结果采用Gel Compare4。5（version 4。5。Applied Maths, Kortrijk, Belgium）进行聚类分析。采用Pearson correlation indices of similarity 和平均连锁法(unweighted pair-group method using arithmeticaverages UPGMA) 绘制聚类树状图。然后将所得到的densitometric curves 输出通过Canoco4。5(Microcomputer Power, Ithaca USA)进行PCA分析。