2。4、BMSCs与Bio-oss的共培养和诱导分化…5

      2。4。1、BMSCs的诱导分化 5

      2。4。2、BMSCs与 Bio-oss 的共培养5

     2。5、ALP染色，microRNA提取及检测… 6

      2。5。1、ALP染色 6

      2。5。2。、microRNA提取及检测 6

3、结果与分析 10

1、引言

股骨头坏死（ONFH）是由于股骨头一部分血液供应的堵塞和不畅，造成股骨头一系列的病理发病过程。多数患者一旦发病，就会遵循缺血、坏死、塌陷、骨性关节炎的发展规律，持续发展。通过对股骨头坏死病因的研究发现其发病原因可能由于三个方面的原因导致：股骨头损伤、过量饮酒以及激素滥用。激素及长时间饮酒会损伤股骨头毛细血管，从而在微循环中形成血栓，同时引起血管内高凝高脂状态，堵塞毛细血管，使股骨头缺乏血液供应，进而出现股骨头缺血性坏死。股骨头坏死的各种治疗方法目前其临床效果不能令人满意，但是如果不采取手术治疗，最终会发展为骨关节面软骨塌陷，在数年甚至数月内关节活动能力及行走能力完全丧失。早期治疗股骨头坏死，可以阻止疾病的发展，防止股骨头塌陷，改善坏死区域的血液循环，促进坏死骨的修复。近年来，随着影像学的发展,医学界对治疗成人股骨头坏死的研究又有了新的方法，现在应用骨髓间充质干细胞治疗成人股骨头坏死也有了新突破。利用骨髓间充质干细胞分化的多项潜能，来改善股骨头坏死区域的血液循环状态，促进病灶部位的血管的再生，以达到早期彻底治疗股骨头坏死的目的。论文网

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs) 具有多向分化潜能，在一定的物理和化学条件和一些细胞因子的诱导下，可定向地向成骨细胞、血管内皮细胞等多种细胞进行分化。还能分泌多种成骨活性因子，已在体外研究及体内骨与软组织损伤修复方面显示出良好的应用前景。BMSCs是存在于骨髓组织中且来源于胚胎发育期的中胚层的一类多能干细胞，是一类有较强增殖能力和自我更新能力，在增殖过程中能快速形成克隆的一类干细胞。在骨髓里提取出来的BMSCs 往往混杂有很多其他类别的细胞，尤其是骨髓造血干细胞。提纯BMSCs 主要有贴壁培养筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法。利用BMSCs 贴壁生长而骨髓造血干细胞不贴壁的特性，目前较常用的筛选法是贴壁培养筛选法，它通过在细胞培养过程中反复换液及传代，使未贴壁生长的其他细胞得以清洗出去，以达到纯化BMSCs 的目的。该方法的优点是操作简单，成本低廉，但纯化程度有限。梯度密度离心法是运用离心力的作用，把颗粒物质分配到梯度的各个位置形成区带，从而分离细胞的一种方法。因此骨髓中的细胞按密度的不同就予以了分离，这种方法的优点是省时、获得细胞率高，并且可以快速获得大量的高纯度细胞。根据BMSCs 的成骨及成血管的特性，骨科、心内科及神经外科等科室已经大量运用BMSCs于临床治疗。但有报道发现干细胞植入与传统髓心减压法疗效无显著差异，其原因可能在单纯干细胞的植入缺乏良好的骨支架材料。Bio-oss 骨粉是一种自体骨替代物质及骨组织再生支架，具有良好的生物相容性。也是一种很有前途的股骨头坏死的骨支架材料。Bio-oss 与骨髓间充质干细胞BMSCs共培养的相关基因分析将为后续实验奠定基础。

2、 材料与方法

2。1、材料

骨髓取自小鼠的股骨和胫骨