2。2、主要试剂

10%胎牛血清FBS的DMEM培养液、0。25%胰蛋白酶（含1mmol/L EDTA，即用1mmol/L-EDTA-Na2配制）、完全培养液、条件培养液（含地塞米松10^-5mmol/L、甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C 50mg/L的DMEM培养基）、10%的福尔马林、ALP（碱性磷酸酶）、RT试剂盒、miR提取试剂盒

2。3、骨髓间充质干细胞的原代取材

2。3。1 、直接全骨髓培养法

取培养了6星期小鼠的股骨和胫骨，用10%的FBS冲洗小鼠的股骨和胫骨，为了避免在冲洗时候产生许多气泡，应缓慢冲且冲的次数不应太多。冲洗后接种在培养瓶中，24---36小时换液，换液时用FBS洗涤两次，7天后进行传代培养，以后2---3天传代。文献综述

2。3。2 、骨髓间充质干细胞的传代培养

1。  传代培养前，在倒置显微镜下观察细胞的生长状况。细胞生长至80---90%即可传代培养

2。  在超净工作台上点燃酒精灯，在酒精灯旁进行传代培养的操作。

3。  传代时应先吸出培养液至培养瓶中，用3ml PBS液两次。 

4。  加入0。25%（2。5g/L，0。25%）胰蛋白酶（含1mmol/L EDTA，即用1mmol/L-EDTA-Na2配制）在37℃的恒温培养箱内消化1~2分钟。

5。  吸去一部分胰酶后，让剩余的胰酶继续消化，然后在显微镜下观察，当细胞开始皱缩变圆时，加入培养液来终止胰酶的反应。

6。  接着用吸管反复吹打培养瓶内壁上的细胞，直至瓶壁上的细胞完全脱落。（吹打时应尽量避免产生气泡）。

7。  接着将反复吹打后的细胞收集于离心管中，离心10分钟，弃上清，再用PBS液洗涤二次以洗去残留的胰蛋白酶。

8。  2---3min后，按1传2的比例传代接种于新的培养瓶中进行培养。

9。  将分装好的培养瓶做好标记，注明细胞的代号，日期等等，再轻轻摇动，以使细胞均匀分布，避免细胞堆积成团，然后置于培养箱中37℃静置培养。传代3次后细胞数量足够可进行诱导分化。

2。4、BMSCs与 Bio-oss 的共培养，诱导分化。

Bio-Oss骨粉是通过多级净化工序从牛骨中提取出的一种高纯度天然骨无机材料，它在化学成份上可与人体骨的无机结构（天然纳米晶体磷灰石）具有极佳的生物相容性，并且不引起炎症反应。由于其多孔结构具有一定的诱导性，可以诱导人体骨的爬行替代，从而在其主成分钙磷降解后为人体骨成分替代。来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

2。4。1 、BMSCs的诱导分化

用条件培养液（含地塞米松10^-5mmol/L、甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C 50mg/L的DMEM培养基），每2d换液，诱导BMSCs向成骨细胞分化，约6d后用作共培养实验。

2。4。2 、BMSCs与 Bio-oss 的共培养

诱导分化后的BMSCs细胞与Bio-oss骨粉共培养：用DMEM培养基浸透Bio-oss骨粉后吸出多余液体，每孔约0。01g颗粒状固体，按5*10^5孔将诱导分化后的BMSCs细胞悬液滴入6孔板，标准条件培养。共培养6d后细胞连接成片，填充于骨粉周边，并分泌细胞外基质，骨粉边缘部分还可见细胞重叠成团。